[發明專利]登革熱病毒Ⅰ型/Ⅱ型雙重熒光PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110139701.X
• 申請日: 2011-05-27
• 公開（公告）號: CN102277447A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 張旭;王國強;劉中華;魏趙延;李秀林
• 申請（專利權）人: 江蘇碩世生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;余光軍

技術領域

本發明涉及一種登革熱病毒體外檢測試劑盒，尤其涉及登革熱病毒I型/II型雙重熒光PCR檢測試劑盒，本發明屬于登革熱病毒血清型的體外檢測領域。?

背景技術

登革熱(Classical?dengue?fever，DF)是由登革熱病毒(dengue?virus)的4個血清型引起的一種急性傳染病，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，臨床上以高熱、出血、全身肌肉和關節痛等為主要癥狀，可伴有皮疹、淋巴腺腫和白細胞減少。登革熱病毒感染除引起登革熱外，嚴重的還可導致登革出血熱(denguehemorrhagic?fever，DHF)或登革休克綜合癥(dengue?shocksyndrome，DSS)等癥狀。DHF以高熱、出血、休克和高病死率為特征，是較為嚴重的一種臨床類型。由于全球氣候變暖、國際旅游頻繁和對蚊蟲缺乏有效的控制，登革熱在世界范圍內發生過多次大流行，全球有100多個國家出現流行，據WHO統計，每年登革熱感染人數有5000萬，全世界有25億人正受到感染登革病毒的威脅，每年均出現幾百萬病例，是較為嚴重的公共衛生問題。?

登革病毒是黃病毒科(flaviviridae)黃病毒屬(flavivirus)登革亞組的重要成員，自然界中存在的登革病毒可分為4個血清型。登革熱的傳?染源主要是處于病毒血癥期的顯性和隱性的感染者，在城市型疫源地區患者和隱性感染者是主要的傳染來源。在新疫區普遍易感。但以青壯年發病率最高。在地方性流行區，20歲以下的居民100％在血清中能檢出抗登革熱病毒的中和抗體，因而發病者多為兒童。?

登革熱的發現已有200多年的歷史，早期記載的報道是1779年埃及開羅、印度尼西亞雅加達及美國費城，根據癥狀命名為關節熱和骨折熱。1869年由英國倫敦皇家內科學會命名為登革熱。中國于1978年在廣東流行，并分離出IV型登革熱病毒。此后，1979年、1980年、1985年小流行中分離出I型、II、III型病毒。目前各地區主要以散在暴發或散發為主，并且以輸入型病例引發的流行居多。?

實時熒光定量PCR技術(Real-time?quantitative?Polymerase?Chain?Reaction，簡稱Real?Time?PCR)是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied?biosystems公司推出，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(cDNA)的起始濃度進行定量的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉錄實時PCR，即實時PCR法(Real-time?RT-PCR)，它是指對DNA或經過反轉入(RT-PCR)的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監測DNA的放大過程，在擴增的指數增長期就測量擴增產物，因為擴增指數增長期測量值與特異DNA(RNA)起始量存在相關性，從而實現定量檢測。RealTime?PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監測CT值而實現對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法最大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現DNA/RNA的精確定?量。該技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏性和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等優點。此外，通過在該體系中加入兩條或者兩條以上引物及對應的探針，便可實現對多種病原體的同時檢測。?

現有的登革熱的體外診斷試劑盒大多存在特異性和靈敏性較低、檢測步驟繁瑣等缺陷，有待改進。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有的登革熱的體外診斷試劑盒所存在的檢測步驟繁瑣以及特異性和靈敏性較低等缺陷，提供一種能夠同時在一個反應管中分別檢測出登革熱病毒I型和II型的雙重熒光PCR檢測試劑盒，具有特異性強、靈敏性高等優點。?

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：?

一種登革熱病毒I型/II型雙重熒光PCR檢測試劑盒，包括以下各組分：RT-PCR反應液、酶混合液、登革熱病毒I型/II型雙重反應液、去RNA酶水。?

其中，所述的登革熱病毒I型/II型雙重反應液由以下2組組分組成：?