[發明專利]由甘油發酵合成1,3-二羥基丙酮的方法

無效

• 申請號: 201110137610.2
• 申請日: 2011-05-26
• 公開（公告）號: CN102250970A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 傅堯;郭慶祥;曹文化;封立剛;騰道路;鄧晉;趙紅;李玉玲;徐清;張穎
• 申請（專利權）人: 徐州恒源生物工程有限公司
• 主分類號: C12P7/26
• 分類號: C12P7/26;C12N1/21;C12N15/53;C12R1/19
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• 代理人: 暫無信息

技術領域：本發明屬于生物有機合成技術領域，涉及1，3-二羥基丙酮的生物有機合成方法。?

背景技術

1，3-二羥基丙酮一種重要的化工、生化原料，醫藥、農藥合成中間體和多功能食品添加劑，用途十分廣泛。二羥基丙酮的合成方法主要有貴重金屬催化氧化法和微生物法。重金屬催化氧化甘油的合成法，由于無法克服催化選擇性差的致命缺點，致使甘油轉化率低于40％，DHA的產率低于25％。工業生產方法目前是利用微生物分批發酵。該法是在菌體生長到適當的時期，利用菌體產生的脫氫酶以甘油為底物進行脫氫反應，產生DHA。用于生產DHA的微生物主要是醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)微生物，尤其是弱氧化醋酸桿菌(Acetobacter?Suboxy-dans)和氧化葡萄糖桿菌(Gluoonobacter?0xydans)。菌種在復蘇后先進行預培養，然后轉發酵罐擴大培養，待菌種達到一定濃度后，接種到含有甘油的發酵培養基當中，經過60-80h的耗氧發酵后，再將發酵液一次放出，經分離純化得到DHA。每一個分批發酵過程都經歷接種、生長繁殖、菌體衰老進而結束發酵，最終提取出產物。目前已有采用分流加甘油方法，在菌體生長到對數期時，并在產物DHA達到一定水平后，放出部分產物，并補加原料和培養基，這樣就可以減少達到生產水平的生物量的時間，提高底物甘油的利用率，節約成本。分批發酵的特點是微生物所處的環境是不斷變化的，發生雜菌污染，能夠很容易終止操作。在發酵生產中，使用的菌種處于對數生長期，把它們接種到發酵罐新鮮培養基時，幾乎不出現調整期，這樣可在短時間內獲得大量生長旺盛的菌體，有利于縮短生產周期。但該法的主要問題是底物甘油和產物DHA在培養基中的濃度過高時產生了高滲透壓，使得發酵菌體裂解、失活，從而導致DHA的產率難以提高。本發明是將從酸性土壤分離和篩選的地衣芽孢桿菌B-05571，使用基因重組和DNA重排技術，將脫氫酶基因整合進大腸桿菌J?M?109，構建甘油脫氫合成1，3-二羥基丙酮的工業工程菌，并采用超分子自組裝模板固定化，然后在含有甘油的培養基中發酵合成1，3-二羥基丙酮。通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1，3-二羥基丙酮。合成工藝路線簡捷，既節能又環保，所獲得的產品質量高和成本低，總質量收率達到75％以上。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種合成由甘油發酵合成1，3-二羥基丙酮的方法，是將從酸性土壤分離和篩選的地衣芽孢桿菌B-05571，使用基因重組和DNA重排技術，將脫氫酶基因整合進大腸桿菌J?M?109，構建甘油脫氫合成1，3-二羥基丙酮的工業工程菌，并采用超分子自組裝模板固定化，然后在含有甘油的培養基中發酵合成1，3-二羥基丙酮。通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1，3-二羥基丙酮。?

本發明通過下述方法實現的：?

地衣芽孢桿菌分離培養基：蒸餾水1000mL，甘油5g，NaCl?5g，酵母粉5g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，調pH7.0，0.1MPa滅菌20min.冷卻至35℃～45℃，加入尼爾紅(Nile?Red)2mL/L(0.30mg?Nile?Red溶于100mL二甲基亞砜)，無菌條件下倒入培養皿，冷卻后備用。?

富營養培養基：蒸餾水1000mL，酵母粉10g，瓊脂粉10g，甘油3g，(NH₄)₂SO₄5g，調pH7.0，0.1MPa滅菌10min.?

產品發酵培養基：?

磷酸鹽緩沖液的配制：蒸餾水1000mL，NaH₂PO₄.12H₂O?8.95g，KH₂PO₄1.5g，pH7.00.1MPa滅菌，15min～20min，備用。?

基因工程菌富集培養基為LB培養基：發酵培養基為添加15.0％甘油的LB培養基，以鼓入空氣作為基因工程菌氧化劑；培養溫度為35℃。?

地衣芽孢桿菌B-05571發酵及DHA的提取：?