[發明專利]一種優化的高活性人溶菌酶基因及其表達載體和應用

有效

• 申請號: 201110136403.5
• 申請日: 2011-05-25
• 公開（公告）號: CN102229939A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 孫同毅;張大偉;王希輝
• 申請（專利權）人: 青島根源生物技術集團有限公司
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/36;C12N15/81;A23K1/165;A23L1/30;A61K38/47;A61P31/04;A61P31/12;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 楊秉利

技術領域

本發明屬于分子生物學制藥技術領域，具體涉及一種優化的人溶菌酶基因及其表達載體和應用。?

背景技術

溶菌酶(Lysozyme)?全稱為1,4-β-N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它由英國細菌學家Fleming在1922年首先在人的唾沫、眼淚和鼻涕中發現，因其能溶解細菌細胞壁而具有溶菌作用而得其名。溶菌酶是人和動物體液和組織中的一種重要的防御因子，具有殺菌效果強，殺菌譜廣，穩定性強，易被機體所接受的特點，還能促進免疫功能恢復，并且沒有任何毒副作用和不良反應。因此溶菌酶作為一種生物制劑，被廣泛應用于食品、飼料工業和臨床醫學。?????人溶菌酶參與機體的防御機制，有抗感染、?抗腫瘤和免疫調節的作用，具有潛在的臨床應用價值，在飼料、食品工業上也具有廣泛的用途。目前，國外已有小規模將人溶菌酶用于臨床的報道，治療效果也較好，且不會產生耐藥性。人溶菌酶是溶菌酶中的一種，通常人溶菌酶是從人奶或胎盤中少量提取獲得。由于其來源困難，不能進行工業化生產，采取DNA?重組技術，從原核或真核表達系統生產人溶菌酶是解決其供需矛盾的有效途徑。釀酒酵母表達系統已被廣泛應用，雖已積累大量經驗，但也存在諸多不足之處，如菌株生長速度慢、密度不高、外源蛋白的表達和翻譯后加工都不夠理想。?

發明內容

本發明針對現有技術中利用釀酒酵母表達系統生產人溶菌酶所存在的菌株生長速度慢、密度不高且外源蛋白的表達和翻譯后加工不理想的不足，提供了一種優化的高活性人溶菌酶基因及其表達載體，本發明利用巴斯德畢赤酵母表達系統來作為生產人溶菌酶的表達系統，它具有生產成本低、操作簡單、生長迅速、表達效率高、轉錄后加工修飾和良好的發酵與分泌性能等優點，本發明優化后的人溶菌酶基因經畢赤酵母表達系統產生的人溶菌酶具有高活性、高表達量的優點。?

為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現：?

本發明提供了一種優化的高活性人溶菌酶基因HZ，它具有序列表SEQ?ID?NO:1的堿基序列，克隆所述基因的特異性引物為：

引物F1：5’-ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’

引物R1：5’-ACGCGGCCGCTTATGGAGCAACGAAGAAAA-3’

引物AOX1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’

3’-?GCAAATGGCATTCTGACATCC?-5’

本發明還提供了一種高活性人溶菌酶，其具有序列表SEQ?ID?NO:1編碼的SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列。

本發明還提供了含有所述人溶菌酶基因HZ的重組載體，所述重組載體為pUC18-T-HZ和pPICZαΑ-HZ。?

本發明還提供了所述人溶菌酶在作為飼料添加劑、食品添加劑和制藥中的應用，所述人溶菌酶可制備用于抗菌、抗病毒、抗腫瘤的藥物，所述人溶菌酶與甘氨酸、植酸、聚合磷酸鹽物質配合使用。?

本發明選擇活性較強的人溶菌酶基因，根據畢赤酵母密碼子的偏好性對基因序列進行優化，并人工合成優化后的人溶菌酶基因，將其與pUC18-T載體連接后轉入大腸桿菌中獲得重組質粒pUC18-T-HZ，以重組質粒pUC18-T-HZ為模板，用F1、R1引物進行PCR擴增得到目的基因片段HZ。將合成的優化后的人溶菌酶基因與真核載體pPICZαΑ連接，構建了重組質粒pPICZαΑ-HZ。將重組質粒pPICZαΑ-HZ線性化后經電擊轉化法轉到畢赤酵母GS115中，篩選能在MD和MM上生長良好的Mut+的菌落，然后經抗生素Zeocin篩選獲得陽性轉化子，將陽性轉化子接種于BMGY液體培養基中，于28?℃，250?r/min搖床培養至OD₆₀₀為2.0－6.0左右，離心收集菌體，后轉接到裝有新鮮BMMY液體培養基中進行誘導表達。同時進行最佳誘導表達條件的探索，以確定表達的最佳條件。誘導結束后，培養液室溫離心收集上清，將誘導上清進行SDS-PAGE，得到與預期一致大小約為15.26kD的目的條帶，Western?blot中將SDS-PAGE中的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用兔抗人溶菌酶的單抗作為一抗，用羊抗兔IgG的酶標抗體作為二抗，最后用二氨基聯苯胺（DAB）顯色。結果表明，目的條帶與兔抗人溶菌酶的單抗發生特異反應，確證重組畢赤酵母分泌表達了人溶菌酶HZ。用溶壁微球菌平板溶圈法鑒定表達產物的活性，檢測得知具有明顯抑菌活性。?

與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是：?