[發(fā)明專(zhuān)利]用BAC-retrieve的方法同時(shí)構(gòu)建條件基因打靶載體和傳統(tǒng)打靶載體

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110135785.X
• 申請(qǐng)日: 2011-05-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102277382A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任凱群;高翔;張健
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種兩用型基因打靶載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法選用BAC-retrieve的方法構(gòu)建條件型打靶載體，所構(gòu)建的載體含有正選基因(neo)和負(fù)選基因(tk)，其中，正選基因的兩端各有FRT序列，LoxP序列分別插入到被去掉的目的序列的兩端，該載體在體外表達(dá)重組酶Cre的情況下，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生傳統(tǒng)型打靶載體，所產(chǎn)生的傳統(tǒng)型打靶載體含有正選基因(neo)和負(fù)選基因(tk)，其中，正選基因的兩端各有FRT序列，負(fù)選基因(tk)位于3’同源臂外側(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的兩用型打靶載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法具體包括下列步驟：

A，129小鼠品系BAC克隆的查詢及訂購(gòu)

B，含有兩段目的基因同源序列PL253載體的構(gòu)建

C，PL253載體與BAC的同源重組

D，第一個(gè)LoxP位點(diǎn)的插入

E，將loxP位點(diǎn)間的NEO剪切掉，從而只留下一個(gè)loxP

F，第二個(gè)LoxP位點(diǎn)，以及FRT-NEO-FRT的插入

G，用測(cè)序的方法驗(yàn)證載體

H，由條件性敲除載體誘導(dǎo)產(chǎn)生傳統(tǒng)型敲除載體

3.一種如權(quán)利要求2所述的第一個(gè)LoxP序列來(lái)自載體pMD18-T-Loxp-Neo-LoxP，通過(guò)PCR的方法將Loxp-Neo-LoxP擴(kuò)增出來(lái)

4.一種如權(quán)利要求2中所述的第二個(gè)LoxP序列來(lái)自載體pMD-18T-frt-neo-frt-loxp，通過(guò)PCR的方法將frt-neo-frt-loxp擴(kuò)增出來(lái)

5.一種如權(quán)利要求2所述的由條件性敲除載體誘導(dǎo)產(chǎn)生傳統(tǒng)型敲除載體是通過(guò)原核表達(dá)Cre重組酶的方法實(shí)現(xiàn)

6.一種如權(quán)利要求1所述的兩用型打靶載體含有線性化位點(diǎn)Not1。