[發(fā)明專利]一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110132203.2
• 申請(qǐng)日: 2011-05-20
• 公開（公告）號(hào): CN102205120A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陶曉珊;劉蕾;胡瀟;申洪銀;李金積;鄒敏;范根成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/23
• 分類號(hào): A61K39/23;A61P31/20
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 鄭明

技術(shù)領(lǐng)域?本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)?豬細(xì)小病毒(Porcine?Parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一。該病的主要特征是懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)、胚胎死亡和胎兒木乃伊化，而母豬本身不表現(xiàn)臨床癥狀，其他豬感染后也無(wú)明顯的臨床癥狀。本病一般呈地方性流行或散發(fā)，有時(shí)也呈現(xiàn)流行性或稱為“暴發(fā)”，這種“暴發(fā)”多見于豬群初次感染，特別是初產(chǎn)母豬癥狀明顯。目前該病已普遍存在于世界各地的豬群中，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

為了減少豬細(xì)小病毒病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的損失，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了廣泛的研究，在疫苗研制上也取得了一定的進(jìn)展。國(guó)外Paul(Paul?PS，Mengeling?WL，Evaluation?of?a?modified?live-virus?vaccine?for?the?prevention?of?porcine?parvovirus?induced?reproductive?disease?in?swine.Am.J.Vet.Res，1980，41(2)：2007-2011)，F(xiàn)ujisaki(Fujisaki，et.al， Establishment?of?the?attenuated?strain?of?porcine?parvovirus?parvovirus?by?serial?at?low?temperature.Natl.Inat，Anim.Health，1982，(22)，1-7)，Akhiro(Akhiro，et.al，Establishment?of?the?attenuated?strain?of?porcine?parvovirus?for?the?live?vaccine?and?its?biological-immunological?characteristics)培育出了豬細(xì)小病毒弱毒活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是采用免疫原性良好的豬細(xì)小病毒(YBF01株)毒株接種于ST細(xì)胞(原始ST細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)和生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)由本發(fā)明人鑒定、建立、保管和供應(yīng)。該細(xì)胞無(wú)致瘤性或無(wú)致癌性，無(wú)細(xì)胞毒性，無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體、外源病毒污染。從現(xiàn)有代次(56代)可連續(xù)使用50代。)培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活，加入礦物油佐劑混合乳化制成。用于預(yù)防由豬細(xì)小病毒引起的豬細(xì)小病毒病。

一、生產(chǎn)用毒株

1.毒種的來(lái)源

制造用豬細(xì)小病毒YBF01株，由本發(fā)明人2000年在山東省某豬場(chǎng)患病豬流產(chǎn)物分離的一株自然弱毒株(PPV-01株病毒)，用蝕斑克隆技術(shù)對(duì)該病毒分離株進(jìn)行克隆，篩選到一株高增殖力毒株，命名為豬細(xì)小病毒(Porcine?Parvovirus)YBF01株(簡(jiǎn)稱PPV-YBF01株)該病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所?中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為：CGMCC?No.4809。在對(duì)該毒株的理化特性及生物學(xué)特性進(jìn)行系列研究、鑒定的基礎(chǔ)上，制備了豬細(xì)小病毒滅活疫苗。

2.YBF01株病毒毒株的特點(diǎn)

(1)致細(xì)胞病變作用?將YBF01株病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀/0.1ml的種毒按1％的量接種于長(zhǎng)勢(shì)良好的ST細(xì)胞，置37℃培養(yǎng)72～96h，出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、脫落，繼而出現(xiàn)空洞、拉網(wǎng)等特異性病變。

(2)病毒含量將YBF01株毒種用細(xì)胞維持液(2％新生牛血清的MEM液，購(gòu)自GIBCO)進(jìn)行10倍系列稀釋，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74個(gè)稀釋度，分別接種于長(zhǎng)勢(shì)良好的ST細(xì)胞(96孔細(xì)胞板)，每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔0.1ml。同時(shí)設(shè)病毒陽(yáng)性對(duì)照孔和細(xì)胞陰性對(duì)照孔，37℃培養(yǎng)和觀察7日，出現(xiàn)CPE者判為感染，計(jì)算TCID₅₀。每0.1ml病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀。

(3)紅細(xì)胞凝集價(jià)種毒液對(duì)0.5％豚鼠紅細(xì)胞血凝效價(jià)應(yīng)不低于1∶256。

(4)毒力取懷孕30～50日豬細(xì)小病毒抗體陰性(HI抗體效價(jià)不高于1∶8)健康初產(chǎn)母豬4頭，分別滴鼻和注射YBF01株種毒液各2.0ml，連續(xù)觀察母豬至分娩，無(wú)流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙出現(xiàn)。該毒株毒力較弱，對(duì)妊娠母豬安全。

(5)免疫原性