[發明專利]一種豬細小病毒滅活疫苗的生產方法

有效

• 申請號: 201110132203.2
• 申請日: 2011-05-20
• 公開（公告）號: CN102205120A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發明（設計）人: 陶曉珊;劉蕾;胡瀟;申洪銀;李金積;鄒敏;范根成
• 申請（專利權）人: 青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: A61K39/23
• 分類號: A61K39/23;A61P31/20
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 鄭明

技術領域?本發明涉及一種豬細小病毒滅活疫苗的生產方法，屬于獸用生物制品領域。

背景技術?豬細小病毒(Porcine?Parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一。該病的主要特征是懷孕母豬發生流產、死產、胚胎死亡和胎兒木乃伊化，而母豬本身不表現臨床癥狀，其他豬感染后也無明顯的臨床癥狀。本病一般呈地方性流行或散發，有時也呈現流行性或稱為“暴發”，這種“暴發”多見于豬群初次感染，特別是初產母豬癥狀明顯。目前該病已普遍存在于世界各地的豬群中，給養豬業造成了巨大經濟損失。

為了減少豬細小病毒病對養豬業造成的損失，國內外許多學者進行了廣泛的研究，在疫苗研制上也取得了一定的進展。國外Paul(Paul?PS，Mengeling?WL，Evaluation?of?a?modified?live-virus?vaccine?for?the?prevention?of?porcine?parvovirus?induced?reproductive?disease?in?swine.Am.J.Vet.Res，1980，41(2)：2007-2011)，Fujisaki(Fujisaki，et.al， Establishment?of?the?attenuated?strain?of?porcine?parvovirus?parvovirus?by?serial?at?low?temperature.Natl.Inat，Anim.Health，1982，(22)，1-7)，Akhiro(Akhiro，et.al，Establishment?of?the?attenuated?strain?of?porcine?parvovirus?for?the?live?vaccine?and?its?biological-immunological?characteristics)培育出了豬細小病毒弱毒活疫苗。

發明內容

本發明的目的是采用免疫原性良好的豬細小病毒(YBF01株)毒株接種于ST細胞(原始ST細胞購自中國獸醫藥品監察所，基礎細胞庫和生產用細胞庫由本發明人鑒定、建立、保管和供應。該細胞無致瘤性或無致癌性，無細胞毒性，無細菌、霉菌、支原體、外源病毒污染。從現有代次(56代)可連續使用50代。)培養，收獲培養物，經甲醛溶液滅活，加入礦物油佐劑混合乳化制成。用于預防由豬細小病毒引起的豬細小病毒病。

一、生產用毒株

1.毒種的來源

制造用豬細小病毒YBF01株，由本發明人2000年在山東省某豬場患病豬流產物分離的一株自然弱毒株(PPV-01株病毒)，用蝕斑克隆技術對該病毒分離株進行克隆，篩選到一株高增殖力毒株，命名為豬細小病毒(Porcine?Parvovirus)YBF01株(簡稱PPV-YBF01株)該病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所?中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCC?No.4809。在對該毒株的理化特性及生物學特性進行系列研究、鑒定的基礎上，制備了豬細小病毒滅活疫苗。

2.YBF01株病毒毒株的特點

(1)致細胞病變作用?將YBF01株病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀/0.1ml的種毒按1％的量接種于長勢良好的ST細胞，置37℃培養72～96h，出現細胞圓縮、脫落，繼而出現空洞、拉網等特異性病變。

(2)病毒含量將YBF01株毒種用細胞維持液(2％新生牛血清的MEM液，購自GIBCO)進行10倍系列稀釋，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74個稀釋度，分別接種于長勢良好的ST細胞(96孔細胞板)，每個稀釋度接種4孔，每孔0.1ml。同時設病毒陽性對照孔和細胞陰性對照孔，37℃培養和觀察7日，出現CPE者判為感染，計算TCID₅₀。每0.1ml病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀。

(3)紅細胞凝集價種毒液對0.5％豚鼠紅細胞血凝效價應不低于1∶256。

(4)毒力取懷孕30～50日豬細小病毒抗體陰性(HI抗體效價不高于1∶8)健康初產母豬4頭，分別滴鼻和注射YBF01株種毒液各2.0ml，連續觀察母豬至分娩，無流產、早產、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙出現。該毒株毒力較弱，對妊娠母豬安全。

(5)免疫原性