[發明專利]用于檢測溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物、探針及方法

有效

• 申請號: 201110131978.8
• 申請日: 2011-05-20
• 公開（公告）號: CN102226215A
• 公開（公告）日: 2011-10-26
• 發明（設計）人: 林霖;楊國武;賴心田;蘭全學;嚴瓊英;祝仁發;李意;陳血建;陳國培
• 申請（專利權）人: 深圳市計量質量檢測研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所 44248
• 代理人: 胡吉科;許建

技術領域

本發明屬于檢驗檢疫領域，尤其涉及用于檢測溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物、探針及方法。

背景技術

溶血性鏈球菌是重要的食源性致病菌，能導致化膿、敗血等癥狀。在日常檢驗中的溶血性鏈球菌屬于常規檢驗項目，檢測任務繁重。在溶血性鏈球菌引起的食品安全事件中，大部分是由A群溶血性鏈球菌感染引起的，但是近年來C、G群溶血性鏈球菌所引起的感染案例呈遞增趨勢。

目前，溶血性鏈球菌的檢測方法主要依據國家標準《GB/T?4789.11-2003食品衛生微生物學檢驗?溶血性鏈球菌檢驗》，以下簡稱為國標方法。國標方法通過革蘭氏染色、觀察溶血、桿菌肽敏感試驗及鏈激酶試驗對溶血性鏈球菌進行微生物學檢驗。

國標方法進行溶血性鏈球菌的檢測需經選擇性增菌、分離純化、生化鑒定等步驟，檢測周期通常需要5~7天。對于污染嚴重的樣品，混雜了大量環境細菌，而在培養過程中，由于目前的增菌液并非很好的選擇性培養基，導致一些非目標菌的大量繁殖，增加了目標菌的分離純化難度，若是檢驗人員沒有足夠豐富的工作經驗則容易導致漏檢。對于一些復雜樣品（如食品），不同的加工工藝導致了其內在成分差異很大，例如含糖量、pH值、含鹽量等，其自身的這些復雜情況可能會改變培養基的成分、pH值、鹽分等，從而干擾細菌的培養，可能導致漏檢。

因此，現有的國標方法存在檢測周期長，檢測步驟繁瑣，對檢驗人員的經驗要求較高，容易導致漏檢的缺點。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題（檢測周期長，檢測步驟繁瑣，對檢驗人員的經驗要求較高，容易導致漏檢），本發明提供用于檢測溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物、探針及方法。

本發明以A、C、G群溶血性鏈球菌的溶血素S為靶基因位點，通過在NCBI數據庫中下載溶血素S的靶基因序列進行序列比對，找到了保守于A、C、G群溶血性鏈球菌中的序列，根據該序列設計熒光PCR引物和探針。

一個方面，本發明提供用于檢測溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR引物和探針，引物和探針的核苷酸序列為：

正向引物P1：5’-GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3’（SEQ?ID?NO：1）；

反向引物P2：5’-AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA?-3’（SEQ?ID?NO：2）；

探針：5’-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3’?（SEQ?ID?NO：3）；

該探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

作為本發明的進一步改進，所述熒光報告基團選自FAM、HEX、TET或JOE；所述熒光淬滅基團為TAMRA。

作為本發明的進一步改進，所述熒光報告基團選自FAM、HEX、TET、JOE、CY3、CY5、ROX、TAMRA或Texas?Red；所述熒光淬滅基團為BHQ。

作為本發明的進一步改進，所述熒光報告基團選自FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA或ROX；所述熒光淬滅基團為ECLIPSE。

另一方面，本發明提供一種用于檢測溶血性鏈球菌全族群的熒光PCR檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

A）DNA模板的制備；

B）配制含有如權利要求1至4中任一項所述引物和探針的反應體系，對DNA模板進行PCR擴增，在ABI7500熒光定量PCR儀上的運行條件為：95℃?3min；95℃?15s，60℃?34s，40個循環，每個循環結束后收集熒光信號；

C）反應結束后，讀取并記錄擴增循環數（Ct），根據擴增循環數進行檢測結果的判斷。

探針熒光基團標記在探針的?5’端，而淬滅基團則在?3’端。當完整的探針與目標序列配對時，5’端發光基團因與?3’端的淬滅基團接近，其發射的熒光被淬滅。當PCR反應到延伸步驟時，DNA聚合酶的?5’外切酶活性將探針酶切斷裂，使發光基團與淬滅基團分離，從而使發光基團發出熒光信號。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累，因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。

Ct值（cycle?threshold，Ct）的定義為：每個反應管內熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數。閾值的設定一般是將其設定為恰好可以覆蓋住陰性對照和空白對照的熒光值處，因此可以很好的去除反應管熒光值即背景。

檢測結果的判定標準為：Ct值≤35時，可判定檢測結果為陽性；Ct值≥40時，可判定檢測結果為陰性；35<Ct值<40時，需適當增加模板量重復擴增，如果得到Ct值≥40，則可判定檢測結果為陰性，否則判定檢測結果為陽性。