[發明專利]一種低產氨基甲酸乙酯葡萄酒酵母的篩選及應用

有效

• 申請號: 201110129484.6
• 申請日: 2011-05-19
• 公開（公告）號: CN102220252A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 王德培;高年發;李磊;張健;高強
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/18
• 分類號: C12N1/18;C12N13/00;C12N15/01;C12G1/022;C12R1/865
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母FI5-1-5菌株，其保藏號為CGMCCN04727?。

2.權利要求1所述菌株的篩選方法，該方法包括以葡萄酒酵母為出發菌株，經紫外線—吖啶橙誘變，篩選獲得刀豆氨酸抗性FI5-1-5菌株；其過程如下：

（1）以活性干酵母F-15和從葡萄園分離出葡萄酒酵母G-1,?并在混合培養基上長出單菌F-15-A1；

（2）篩選獲得刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1經活化培養，其條件為取新鮮培養的斜面菌苔一環，加入盛有10mL，5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38~40℃水浴中活化20~30min，直至有大量氣泡產生；

（3）將上述培養活化后的菌株，接種至含有刀豆氨酸、精氨酸、鳥氨酸的混合氨基酸初篩培養基中進行培養；

（4）挑取可在混合氨基酸初篩培養基上生長的菌落，分別移接至精氨酸、鳥氨酸復篩培養基中培養；

（5）選擇在精氨酸復篩培養基中不能生長，而在鳥氨酸復篩培養基中可以生長的菌種為所需的刀豆氨酸抗性菌株B1，編號為FI5-1-5菌株?(CGMCCN₀4727)；

(6)將分離出來的刀豆氨酸抗性菌株B1，接種YEPD液體培養基活化24h后，吸取0.1mL菌液涂布在混合培養基培養3d，在混合培養基上可以長出菌落的菌株進行保存。

3.權利要求2所述的篩選方法，其中所述經紫外線—吖啶橙誘變的方法是：取生長良好的F-15-A1種子液,在紫外照射90s，然后把600μL經過紫外誘變的菌懸液接入到含有5mL誘變培養基的試管中30℃避光水浴振蕩培養12h；其中誘變培養基中含有1mg/mL吖啶橙，劑量分別為80μL，100μL，150μL，200μL，250μL。

4.權利要求2所述的篩選方法，其中步驟(3)中所述的初篩培養基指的是瓊脂培養基和刀豆氨酸培養基：其中瓊脂培養基為：2%瓊脂，2%葡萄糖，50mL純水在115℃滅菌15min,50℃水浴保溫；刀豆氨酸培養基為：1.7g/L?YDB，1mg刀豆氨酸，10.0mM鳥氨酸，10mM精氨酸，純水50MmL，過濾滅菌于50℃水浴保溫；將這兩種培養基混合，迅速到平板即制得初篩培養基。

5.權利要求2所述的篩選方法，其中步驟(4)中所指的精氨酸、鳥氨酸復篩培養基成分為：(1)?精氨酸培養基：1.7g/L?YDB，10mM精氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L瓊脂；(2)鳥氨酸培養基：1.7g/L?YDB，10mM鳥氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L瓊脂。

6.權利要求2-5任一項所述的篩選方法，其中還包括：驗證精氨酸酶活低的葡萄酒酵母，該驗證步驟和方法為：將活性干酵母F-15和F-15-A1和B1分別接種到YEPD中，30℃過夜培養，發酵液5000r/min離心5min收集菌體，用無菌水洗3次，轉接到精氨酸酶誘導培養基上30℃培養5h，測定活性干酵母F-15、F-15-A1和B1的精氨酸酶的活性，每個菌株作三個重復，1個精氨酸酶的活力單位定義為在pH9.5及37℃下，在0.1M精氨酸溶液中，每min產生1nmol鳥氨酸所用酶的量。

7.權利要求2-5任一項所述的篩選方法，其中還包括：驗證氨基甲酸乙酯低的葡萄酒酵母，該驗證步驟和方法為：

模擬葡萄汁發酵的驗證步驟和方法：

①模擬葡萄汁培養配制：儲液A：在375?mL蒸餾水中加入葡萄糖100g，果糖100g，定容至500mL；儲液B：在250mL蒸餾水中加入L-酒石酸6g，L-蘋果酸3g，檸檬酸0.5?g；儲液C：在250mL蒸餾水中加入無硫酸氨的氮基礎培養基1.7g，肌醇6?mg，氯化鈣0.2g，磷酸銨1g，L-精氨酸0.8g，L-脯氨酸1g，DL-色氨酸0.1g；將儲液A、B、C混合后用氫氧化鉀調節pH至3.25，過濾除菌；

???②模擬葡萄汁發酵：將編號為FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)斜面保存的菌苔轉接到裝有50mL模擬葡萄汁培養基的三角瓶中，在30℃，150r/min條件下過夜培養；然后再將50mL過夜培養物轉接到500mL模擬葡萄汁培養基中，在26℃下靜置厭氧發酵5～7天，發酵結束后取樣測定氨基甲酸乙酯含量。

8.權利要求2-4所述的篩選方法，其中被篩選的葡萄酒酵母F-15-A1、G-1為未經基因修飾的酵母；篩選出的編號為FI5-1-5菌株是經過基因修飾的。