[發明專利]家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法

有效

• 申請號: 201110123586.7
• 申請日: 2011-05-13
• 公開（公告）號: CN102242147A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 周繼勇;鐘伯雄;顏焰;危浩;阮系真;莊蘭芳;鄭育良
• 申請（專利權）人: 浙江同點生物科技有限公司;浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林懷禹

技術領域

本發明涉及利用轉基因技術構建一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法。

背景技術

狂犬病是當今世界公共衛生中有嚴重威脅的傳染病之一。狂犬病是由狂犬病病毒感染恒溫動物或人引起，導致動物或者人急性致死性腦脊髓炎，臨床特征主要表現為狂燥不安、行為反常、攻擊性、進行性麻痹和最終死亡，是一種人獸共患傳染病。其特點是潛伏期長，致死率高，幾乎100%死亡。

狂犬病病毒屬于彈狀病毒科彈狀病毒屬，是單鏈不分節負鏈RNA病毒，病毒外形呈彈狀，一端純圓，一端平凹，有囊膜，內含衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內含有單鏈RNA。

狂犬病病毒的基因組全長約12kb，基因組的3’端至5’端排列著N、P、M、G、L?5個結構基因，各基因序列的長度分別為1424、991、805、1675和6475bp，它們分別編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L或RNA依賴的?RNA轉錄酶蛋白)。

狂犬病病毒有兩種主要抗原：一種是病毒外膜上的糖蛋白抗原，它能與乙酰膽堿受體結合，表現出神經毒性，能使體內產生中和抗體及血凝抑制抗體；另一種為內層的核蛋白抗原，它使體內產生補體結合抗體和沉淀素。

N蛋白基因全長1424個核苷酸．編碼450個氨基酸，相對分子質量為50.5Da。在成熟的病毒粒子中，N蛋白是構成核衣殼螺旋對稱結構的主要成分之一，是病毒中最穩定的蛋白，可用作檢測抗原，也是狂犬病病毒基因分型的主要依據。N蛋白與狂犬病病毒基因組中的RNA結合，形成RNP結合物，能保護病毒RNA免遭核酸酶破壞。N蛋白是一個磷酸化蛋白，C端?第389位Ser為磷酸化位點，能調節病毒的轉錄和復制水平。N蛋白能夠誘導細胞免疫。

轉基因家蠶中部絲腺生物反應器是在家蠶中部絲腺中表達外源基因的轉基因動物表達系統。家蠶生長周期短，50天左右可完成一個世代，每個雌蛾可產卵約400粒；家蠶經過長達四千多年的人工馴養、選育，性情溫順，已完成喪失飛翔逃逸能力，而在絲蛋白合成、分泌方面具有非常強的能力；合成的蛋白可以隨蠶絲蛋白一起分泌到體外，蠶絲蛋白主要由3種絲素蛋白和3種絲膠蛋白構成，成分簡單。所以，轉基因家蠶絲腺生物反應器構建容易，運行安全，表達外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白純化方便，只需要通過飼養轉基因家蠶，就可以非常方便地維持表達系統的延續，是一種非常有價值的表達系統,具有廣闊的實用前景。

發明內容

本發明的目的在于提供一種家蠶中部絲腺細胞合成分泌狂犬病病毒核蛋白的方法，是利用轉基因家蠶技術將狂犬病病毒核蛋白基因導入家蠶基因組內，并在家蠶中部絲腺細胞中特異表達，開發出合成分泌狂犬病病毒核蛋白的家蠶，為利用狂犬病病毒核蛋白研制更加安全、高效、經濟和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基礎。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案的步驟如下：

（1）采用分子生物學技術構建家蠶合成分泌狂犬病病毒核蛋白的載體pBSer1RVNP-A3EGFP質粒；

（2）采用顯微注射轉基因家蠶方法將pBSer1RVNP-A3EGFP質粒及能夠提供轉座酶trans的輔助質粒導入家蠶已解除滯育的受精卵內，蠶卵孵化后飼養至成蟲，自交續代為G1代，在G1代轉基因家蠶的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選擇表達EGFP標志基因的轉基因家蠶，飼養至成蟲自交續代為G2代，G2代以后均采用蛾區育，成蟲自交續代，再經1-3代選種，每代采用轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，以表達EGFP標志基因及絲膠蠶性狀為留種篩選標志，育成中部絲腺細胞能夠合成分泌狂犬病病毒核蛋白、基因純合的轉基因家蠶新品種。

所述的pBSer1RVNP-A3EGFP質粒是以piggyBac轉座質粒為基礎，質粒帶有Amp抗性基因以用于質粒的擴增和篩選，包含?piggyBac轉座子的2個轉座臂PBL和PBR，包含?2個功能表達框，一個是A3啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因表達框A3?Promoter+EGFP+SV40，以用作轉基因陽性家蠶的篩選標志，另一個是家蠶絲膠蛋白1啟動子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及狂犬病病毒核蛋白基因的表達框Ser1?Promoter?+His+hLYZ+SV40，以表達狂犬病病毒核蛋白，輔助質粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉座子的1個轉座臂PBR、A3啟動子啟動的轉座酶trans基因表達框A3?Promoter+?trans，以提供轉座酶。