[發(fā)明專(zhuān)利]NBS Profiling鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110118999.6
• 申請(qǐng)日: 2011-05-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102191331A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳紅芝;金壽林;吳景芝;陳溪
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 昆明合眾智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 53113
• 代理人: 康珉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及應(yīng)用NBS?Profiling分子技術(shù)，調(diào)查植物品種或資源與潛在親本的起源關(guān)系。本發(fā)明描述了NBS?Profiling在植物雜交育種中雜交后代的雜種真實(shí)性的早期鑒定、及具有重要經(jīng)濟(jì)和研究?jī)r(jià)值植物品種或材料的親本起源鑒定中的方法。

背景技術(shù)

NBS?Profiling是一種基于生物核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-亮氨酸富集重復(fù)序列（nucleotide-binding?site-leucine-rich?repeat，NBS-LRR）高度保守的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)NBS引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得特異性分子片段或標(biāo)記的方法。已知植物抗病基因都具有幾個(gè)高度保守的NBS-LRR?區(qū)域，針對(duì)植物抗病基因和抗病基因同源序列NBS-LRR保守序列設(shè)計(jì)發(fā)明的NBS?Profiling技術(shù)，是一種高度可靠的DNA多位點(diǎn)文庫(kù)構(gòu)建、且可以免費(fèi)使用的技術(shù)，具有與AFLP、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)相似的顯性多位點(diǎn)標(biāo)記體系的特點(diǎn)。自C.?G?van?der?Linden（Theoretical?and?Applied?Genetics?(2004)?109:?384–393?“Efficient?targeting?of?plant?disease?resistance?loci?using?NBS?profiling”（利用NBS?Profiling有效標(biāo)定植物病害抗性位點(diǎn)））建立NBS?Profiling技術(shù)以來(lái)，已成功的應(yīng)用于許多重要作物，如馬鈴薯、番茄、水稻、大麥、萵苣、葡萄等的抗病基因的分離鑒定和序列分析。

現(xiàn)代植物育種，經(jīng)常利用野生資源與栽培品種的雜交，將野生資源中的抗逆、抗病等重要性狀的基因轉(zhuǎn)移到栽培種中。但由于種間雜交親緣關(guān)系遠(yuǎn)、且無(wú)法完全去雄或隔離授粉，雜交后獲得的后代有些不是真正的雜交種。對(duì)于像球根花卉水仙、郁金香、百合，木本植物金絲桃、杜鵑花、蘋(píng)果等生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的植物，如果能在種子苗早期將非雜交后代的自交苗識(shí)別去除，可以節(jié)省栽培管理這些材料的大量人力、物力，將大大的降低育種成本。此外，了解和弄清一些長(zhǎng)期使用，但親本來(lái)源不清、性狀優(yōu)良栽培品種的親本來(lái)源，有助于這些品種的性狀改良。

現(xiàn)有鑒定植物雜交后代或品種與親本遺傳關(guān)系的方法中，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法存在從種子播種到植株長(zhǎng)成、開(kāi)花結(jié)果耗時(shí)長(zhǎng)，受環(huán)境因素影響大等缺點(diǎn)；分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法-基因原位雜交（genomic?in?situ?hybridization,?GISH?）雖然能夠有效的鑒定親本與雜交后代的遺傳關(guān)系，但該方法從染色體制片開(kāi)始到完成鑒定至少需要一周以上，非常耗時(shí)耗力，操作人員必須具有豐富的經(jīng)驗(yàn)和好的操作技能才能應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)，因此實(shí)際應(yīng)用受到了極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有鑒定技術(shù)周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、或技術(shù)要求高等缺點(diǎn)，提供一種新的鑒定雜交后代雜種性、物種起源的方法。

本發(fā)明的發(fā)明人研究得出通過(guò)比較NBS?Profiling擴(kuò)增片段的相似性，可高效準(zhǔn)確地分析鑒定植物雜交后代的雜種性或栽培品種與潛在親本的遺傳關(guān)系。

本發(fā)明所述的一種NBS?Profiling鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源的方法，按以下步驟進(jìn)行：

（1）供DNA提取的幼葉的采集與保存；

（2）總DNA的分離純化；

（3）進(jìn)行酶切反應(yīng)，對(duì)酶切反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，DNA限制性酶消解和末端受體連接；

（4）NBS?Profiling?擴(kuò)增，包括兩步PCR反應(yīng)；

（5）擴(kuò)增片段的聚丙烯酰胺膠分析和植物雜交后代雜種性、物種起源的判定。

采用本發(fā)明方法，可以早期快速地鑒定植物育種雜交后代的雜種性，提高育種效率；可以比較鑒定一些親本來(lái)源不清、性狀優(yōu)良栽培品種的親本起源，輔助這些品種的性狀改良；可以追溯鑒定一些重要植物資源的親本起源，促進(jìn)這些資源的進(jìn)一步應(yīng)用。NBS?Profiling可以鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源，理論推導(dǎo)可能是由于NBS序列高度保守、能夠穩(wěn)定遺傳給后代的特點(diǎn)，雜交后代的NBS序列應(yīng)該和其母本和（或）父本一致。

附圖說(shuō)明