[發(fā)明專利]人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)人2.5Sβ-神經(jīng)生長(zhǎng)因子及分離純化的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110116404.3
• 申請(qǐng)日: 2011-05-06
• 公開（公告）號(hào): CN102220338A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊國(guó)成;夏臘菊;周波;楊媛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢北度生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/85;C07K14/48;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSC)表達(dá)人2.5Sβ-神經(jīng)生長(zhǎng)因子(2.5Sβ-NGF)及分離純化的方法。

背景技術(shù)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。NGF包含α、β、γ三個(gè)亞單位，活性區(qū)是β亞單位，由兩個(gè)118個(gè)氨基酸組成的單鏈通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成的二聚體。NGF在人體內(nèi)主要分布于腦、神經(jīng)節(jié)、虹膜、心臟、脾、胎盤等組織及成纖維細(xì)胞、平滑肌、骨骼肌、膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞等。NGF與受體結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制產(chǎn)生內(nèi)在化，形成由軸膜包繞、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，經(jīng)軸突沿微管逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體，經(jīng)酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇鈣、內(nèi)源性環(huán)腺苷酸等第二信使體系的轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)靶細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)或功能蛋白基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控而發(fā)揮其生物效應(yīng)。

大鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明：神經(jīng)生長(zhǎng)因子可改善由己二酮和丙烯酰胺造成的大鼠中毒性周圍神經(jīng)病所致的肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙，縮短神經(jīng)-肌肉動(dòng)作電位潛伏期，并提高神經(jīng)-肌肉動(dòng)作電位幅度。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子有減輕動(dòng)物脛神經(jīng)的髓鞘腫脹發(fā)生率和降低變性脛神經(jīng)纖維數(shù)量等作用。以上結(jié)果提示神經(jīng)生長(zhǎng)因子可能有促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。目前，生產(chǎn)2.5Sβ-NGF的方法主要從小鼠頜下腺提取，還沒見到利用HUMSC表達(dá)的報(bào)道。

利用HUMSC細(xì)胞表達(dá)2.5Sβ-NGF是新一代NGF表達(dá)系統(tǒng)，它克服了傳統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)不能進(jìn)行翻譯后的修飾活性低等缺點(diǎn)。利用基因重組技術(shù)表達(dá)人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的優(yōu)點(diǎn)是NGF的結(jié)構(gòu)和功能與人體天然的NGF結(jié)構(gòu)和功能完全一致，沒有免疫原性，具有半衰期較長(zhǎng)，沒有鼠源性病毒交叉感染的安全隱患等優(yōu)點(diǎn)。在臨床上治療神經(jīng)損傷，促進(jìn)損傷神經(jīng)恢復(fù)方面占有重要地位。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用HUMSC干細(xì)胞表達(dá)重組人2.5SβNGF，采用等電點(diǎn)沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP層析三步聯(lián)用法分離純化法。

人體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)人體2.5Sβ-神經(jīng)生長(zhǎng)因子及分離純化的方法，包括如下步驟：

1、HUMSC原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)；

2、傳代擴(kuò)增；

3、凍存：

4、2.5Sβ-NGF克隆、誘導(dǎo)分化與擴(kuò)增；

5、HUMSC的微載體擴(kuò)增；

6、2.5Sβ-NGF的分離純化。

該方法的有益效果是：具有比傳統(tǒng)親和層析、離子交換層析和疏水層析法具有分離規(guī)模大、產(chǎn)品純度高、活性高和收率高等優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一、HUMSC原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

1、取破宮產(chǎn)無菌臍帶20cm，置無菌生理鹽水瓶中，4℃保存。

2、生物安全柜中清洗臍帶血漬，將臍帶剪成5cm片段，剔除血管，PBS洗滌2次。

3、將8cm長(zhǎng)的臍帶轉(zhuǎn)移到10cm的培養(yǎng)皿中，加入青霉素和鏈霉素，濃度分別為100單位/ml和100微克/ml。

4、將臍帶剪成10mm³小塊，加入10％I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化，工作濃度為0.1％(含3mM的CaCl₂，)，混勻，37℃消化4小時(shí)。

5、STEMPRO?MSC?SFM培養(yǎng)：消化液用200目過濾，細(xì)胞懸液300G離心5分鐘，收集細(xì)胞，接種于25T細(xì)胞瓶培養(yǎng)，溫度37℃，飽和濕度，5％CO₂。

6、3天后換液，除去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)用STEMPRO?MSC?SFM培養(yǎng)。

二、傳代擴(kuò)增

1、原代細(xì)胞培養(yǎng)12天后，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞達(dá)到80％生長(zhǎng)面積，集落生長(zhǎng)達(dá)到95％融合可進(jìn)行傳代，P1代后90％融合后可傳代。

2、棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，0.5％胰蛋白酶-EDTA消化40秒。

3、STEMPRO?MSC?SFM中和胰蛋白酶，離心收獲細(xì)胞，STEMPRO?MSCSFM分瓶培養(yǎng)傳代。

三、凍存

1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUMSC加10％DMSO和FBS于凍存管按凍存曲線在程控降溫儀中降溫，降溫結(jié)束后置液氮中保存。

四、2.5Sβ-NGF克隆、誘導(dǎo)分化與擴(kuò)增