[發明專利]一種大電流篩選大腸桿菌育種的方法

無效

• 申請號: 201110114337.1
• 申請日: 2011-05-04
• 公開（公告）號: CN102220306A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 馬潔;李明
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N1/20;C12R1/19
• 代理公司: 北京東方匯眾知識產權代理事務所(普通合伙) 11296
• 代理人: 劉淑芬

技術領域：

本發明屬于微生物育種領域，涉及提高大腸桿菌BL21生長量的方法，具體是通過控制直流電的電流大小，篩選出對大電流具有耐受性的菌株，使其在無電流壓力的情況下提高生長量，并且使這種生長優勢能夠保持多代。

技術背景：

電場對細胞生長及代謝的影響是生物化工、生物醫藥以及環境工程的重要研究課題，引起眾多研究者的關注。微生物細胞的電解刺激技術已在酵母發酵體系、生物脫氮體系、有機廢水降解體系等領域中得到初步應用，在工業微生物培養和環境修復電刺激方面顯示出良好的應用前景。一般認為小電流能夠促進微生物的生長，而大電流對微生物細胞施加負面影響，對微生物起到殺菌的作用。所以，電解刺激技術中多使用小電流促進微生物生長，而大電流多用于食品殺菌、保存以及某些加工過程。然而極端環境下存活的微生物在撤銷環境壓力后可以得到某些遺傳特性，但是利用大電流篩選微生物以提高微生物生長量的研究卻未見報道。

據《生物化學與生物物理學報》2001，33(1)報道，高翔等利用高壓力誘變大腸桿菌TG1、DH5αP和HB101P得到了耐壓的突變菌株TG1P、DH5αP和HB101P，使其在220MPa高壓下的存活率提高了2～3個數量級。

據《現代生物醫學進展》2006，6(4)報道，朱傳合等利用微波誘變阿維拉霉素產生菌SV獲得1株阿拉維霉素的突變菌株SV-15，產量達到21.5mg/L，較出發菌提高119.4％。

據《Bioresource?Technology》2007，98(18)報道，Walid?A?Lotfy等利用紫外線檸檬酸產生菌Aspergilbus-niger?UMIP2564獲得成品收率達到60.25％的變異菌株W5。

據《微生物學通報》2010.37(10)報道，本實驗室孫西同等通過小電流刺激大腸桿菌，提高了大腸桿菌的生長量。但小電流刺激的大腸桿菌必須在通電情況下才能表現出生長優勢，一旦取消通電，其生長優勢很快消失。

發明內容：

本發明目的是針對具有清楚遺傳背景的大腸桿菌進行大電流篩選得到耐受菌株，撤銷電流壓力后，使獲得的大腸桿菌更具有生長優勢，并且使這一優勢能夠保持3～4代。

本發明在小電流篩選大腸桿菌的基礎上，利用大電流篩選大腸桿菌，撤銷電流后獲得的大腸桿菌生長量增加，并且使這種生長優勢能夠保持多代。

利用大電流篩選大腸桿菌的方法，需要選擇合適的電極、電流，并且控制電流大小使其維持恒定。

一種大電流篩選大腸桿菌育種的方法，選擇在大電流環境中仍能存活的耐受菌株，撤銷電流壓力后，提高大腸桿菌的生長量，并且使得這種生長優勢能夠保持多代，其特征是選擇Yi-Ti或者Pt做電極，并且使陰極、陽極之間保持0.5～10cm的距離。將大腸桿菌種子液置于50～130mA的大電流環境中培養8～24h，劃板，25℃～40℃恒溫培養12～96h。

與現有微生物育種的方法相比，該方法具有能夠保持多代生長優勢，簡單易操作，清潔無污染的特點。

附圖說明

圖1經100mA直流電篩選后的大腸桿菌生長曲線。

圖2經110mA直流電篩選后的大腸桿菌生長曲線。

具體實施方式

實例1：選用通用的模式菌大腸桿菌BL21，施加100mA直流電作用于大腸桿菌BL21，篩選出大電流耐受菌株BL21E100

1.1種子培養：取50μL甘油保存菌種，接入250mL裝有100mL培養基的錐形瓶中，30℃，130r/min水浴搖床培養18小時。

1.2誘變培養：取4mL種子液于裝有300mL培養基的三口玻璃電解瓶中，Yi-Ti電極做為陰極；Pt電極做為陽極，控制電流大小保持100mA恒定，并且使大腸桿菌在電場環境中持續培養24小時。劃板，37℃恒溫箱培養48h，獲得大電流耐受菌BL21E100。

1.3100mA直流電篩選后的大腸桿菌的生長量檢測

經100mA直流電處理后的大腸桿菌，用生長曲線表示其生長情況，如圖1所示，發現18hBL21E100較原菌的生長量提高最大，ΔOD＝0.221。然后用干重表示大腸桿菌的生長量，如表1所示，發現和原菌比較，BL21E100的生長量優勢保持了4代，其中第一代增長率最大，比原菌提高了36.8％。

實例2：施加110mA直流電作用于大腸桿菌BL21，篩選出大電流耐受菌株BL21E110

1.1種子培養：取50μL甘油保存菌種，接入250mL裝有100mL培養基的錐形瓶中，30℃，130r/min水浴搖床培養18小時。