[發明專利]鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒及其應用無效

申請號：	201110103515.0	申請日：	2011-04-25
公開（公告）號：	CN102221611A	公開（公告）日：	2011-10-19
發明（設計）人：	劉興友;劉明成;王麗榮;胡建和	申請（專利權）人：	河南科技學院
主分類號：	G01N33/569	分類號：	G01N33/569;G01N33/577;G01N33/531
代理公司：	鄭州大通專利商標代理有限公司 41111	代理人：	樊羿
地址：	453003 河南省新鄉***	國省代碼：	河南;41
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摘要：
搜索關鍵詞：	鴨源性冠狀病毒夾心 elisa 試劑盒及其應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術，具體涉及一種鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒及其應用。

背景技術

河南省鄭州某養殖場2004年5月發生了以腹瀉和生長遲緩為主要癥狀的疑似IB疾病，感染雞主要表現精神沉郁，下痢，生長緩慢及抵抗力下降，發病率為100%，死亡率達10%?以上，感染雞群的生產性能顯著降低。調查中顯示，與雞舍相距僅150米左右處有一個1700只的肉鴨群，在第一批雞發病前約10天左右鴨群發生過類似癥狀的疾病。死亡雞病變主要為小腸出血，腸壁變薄，有的有潰蕩，小腸絨毛脫落,腺胃乳頭腫大、粘膜脫落，有的肌胃和腺胃交界處有出血，肌胃有出血或潰蕩，腎臟腫大，呈“花斑腎”，肺臟無明顯變化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎縮；病鴨剖檢以腎臟腫大，蒼白兼有出血、腿肌及肝臟出血為主要特征。在同地區的其他雞場也發生了同樣癥狀的疾病，雖然經過多種IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技學院動物科學學院開展了對該疫病的研究工作，結果從發病鴨體內分離到一株病毒，鑒定為IBV，命名為鴨源性冠狀病毒ZZ2004株（保藏編號：CGMCC?NO.3842），其專利文獻公開號為CN?101906404A，此為首次有關家鴨感染IBV的報道。本病毒分離株ZZ2004來自雞鴨混養的養殖場，其不僅引起雞的大批發病及死亡，還感染了鴨群，嚴重影響了家鴨的生長發育并導致鴨的死亡。與其它禽類的冠狀病毒相比，鴨源性冠狀病毒ZZ2004變異的程度較大，對動物的感染譜更廣。

目前，國內外已建立了許多IBV相關的診斷技術，主要分為抗體檢測和抗原檢測兩大類。抗體檢測方法包括間接免疫熒光法、ELISA法、免疫過氧化物酶單層細胞試驗、中和試驗等。目前所有針對抗體的檢測方法都無法區分免疫雞群和感染雞群，從而影響疫病的及時、有效防控。而抗原檢測方法則結果較直接，能明確病毒感染。針對IBV抗原檢測的方法主要有RT-PCR法、病毒分離、免疫組化等，各方法均存在一些不足之處。例如，病毒分離方法耗時、費力；免疫組化方法操作繁瑣，影響因素較多，并且結果判斷具有一定的主觀性；RT-PCR方法對檢測人員實驗操作技能要求較嚴格，且成本較高。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種特異性強、精確度高、操作簡便、檢測快速的鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒，并公開了其應用方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

一種鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒，包括洗滌液、封閉液、底物顯色液、終止液，其還包括：

（1）包被抗體的酶標板：以抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗作為包被抗體，用包被液將單抗稀釋到10μg/ml，每孔加入100μL，4℃冰箱中過夜，用洗滌液PBST洗滌2～4次，再向酶標板中加入5%（g/mL）的BSA封閉液，100μL/孔，37℃反應2h，洗滌液PBST洗滌2～4次；

（2）捕獲抗體：兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗；

（3）酶標抗體：HRP標記的羊抗兔IgG。

所述抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗由保藏編號為?CGMCC?NO.4171的雜交瘤細胞株3H10分泌制得。

所述兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗的制備方法如下：

將病毒進行純化，選擇2.0～2.5㎏之間的大白兔進行四次免疫，時間分別為第1天，第14天，第28天和第30天，第4次免疫后一周進行心臟采血，分離血清，即得兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗。

所述鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒的應用方法，包括以下步驟：

（1）加待檢樣品：取試劑盒中的包被抗體的酶標板，向其中加入經過處理的待檢樣品，100μL/孔，同時分別設立陽性對照和陰性對照，37℃下反應25～35min，洗滌液PBST洗滌2～4次；