[發明專利]Lrrc10小分子及其在制備治療心肌肥厚藥物中的應用

有效

• 申請號: 201110103175.1
• 申請日: 2011-04-25
• 公開（公告）號: CN102166346A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 吳秀山
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;C12Q1/68;A61P9/00
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所 43205
• 代理人: 寧星耀

技術領域

本發明涉及一種心臟特異性表達的亮氨酸豐富蛋白10（Lrrc10）小分子及其構建方法與在制備治療心肌肥厚藥物中的應用。

背景技術

心臟病是近幾十年來影響人類生命健康的主要危險因素之一，其最終的結果是導致人的心臟衰竭。患者在心衰之前，其心臟會經歷一個肥大增生的過程，即心肌肥厚，這一過程通過心肌細胞效應于某種外界的病理刺激，進而激活細胞內部的一些信號通路而完成，這些信號通路包括MAPK信號通路、G蛋白偶聯受體信號通路、calcineurin-NFAT通路和?PI3K-AKT通路等等。信號通路由特定的受體、信號轉導通路和效應終端所構成。所以，理論上，在心臟遭到一些病理信號刺激時，如果能抑制這些通路的激活，就能有效治療和預防心臟病。

由于生物體內信號通路并非心臟器官所獨有，各種信號通路普遍存在于生物體的各個組織和細胞中，這些信號通路對機體的機能都是至關重要的，所以靶向這些信號通路的藥物，通常會出現一些副作用。比如針對于calcineurin-NFAT通路開發的抑制性藥物就表現出免疫抑制反應和對腎的毒害作用。篩選到一種新的具有更高組織特異性的小分子藥物靶點，成為研制開發新型低副作用治療心臟疾病藥物的一大挑戰。

發明內容

本發明的目的是提供一種心臟特異性表達的Lrrc10小分子蛋白及其構建方法，以及Lrrc10小分子蛋白在制備治療心肌肥厚的低副作用小分子藥物中的應用。

本發明的技術方案是：

研究表明，SRF基因(基因銀行登記號GI:61743976)?是維持心臟正常功能的重要蛋白因子。利用小鼠轉基因技術，使得SRF中等程度在心肌細胞中過表達，就能較強的誘導心肌肥厚，使小鼠在出生后很快由于心衰而死亡。在心肌細胞中，即使SRF輕微的過表達，也能使小鼠心臟過早衰老。利用基因敲除技術，將SRF基因在小鼠心臟中特異性敲除，也可以導致心肌肥大和心臟衰竭。但是研究表明，適當的降低SRF在小鼠心臟中的表達量，能使心臟獲得一個更好的功能，表現出在病理刺激下不容易出現心衰的現象。另外，研究還發現，小鼠心臟中SRF的含量，是隨著小鼠年齡的增加而逐漸升高的。在小鼠心臟中降低SRF的表達量，能使心臟趨于年輕化。SRF是一個非常有名的轉錄因子，在心臟和肌肉中均有較強的表達。作為一個轉錄因子，它經常和其他的轉錄輔助因子發生相互作用，一起調控下游基因的表達。雖然SRF并非組織特異性的因子，但是與其相互作用的某些輔助因子具有組織特異性；二者共同作用調控特定的生理過程，從而可實現SRF在其功能上的廣泛性和特異性。

Lrrc10?基因(基因銀行登記號GI:63003902)是一個無內含子的功能基因，編碼含有7個LRR?保守結構域的蛋白，LRR結構域具有為蛋白質相互作用提供作用框架的功能。研究表明，?Lrrc?10基因在小鼠心臟組織中有大量而特異性的表達，在小鼠胚胎期的心臟與NKX2-5?有極其相似的表達部位，亞細胞定位實驗顯示其在細胞質與細胞核都有表達，出生后表達升高。進一步分離的新生大鼠心肌細胞實驗證明了Lrrc?10?基因在Z-線上和橫小管上表達。但斑馬魚和小鼠LRRC10在胚胎心臟發育中的作用相反，小鼠Lrrc?10對其心臟發育無影響，而小鼠Lrrc?10在心臟特異表達，提示該基因可能與維持成體心臟的功能有關。Lrrc?10?基因在人類與小鼠中的相似性高達84％（氨基酸水平），提示該基因在維持人類成體心臟功能中發揮著重要的作用。

本發明建立了以下Lrrc10小分子構建方法：（1）通過酵母雙雜交的方法釣取與SRF相互作用的蛋白分子；（2）通過心肌肥大模型篩選在心臟表達下調的候選基因并通過相關性分析，得到一個在心臟中特異性表達的亮氨酸豐富蛋白10（Lrrc10）小分子；（3）將其作為候選分子，進行功能鑒定。

本發明構建了含有Lrrc10基因(基因銀行登記號GI:63003902)的腺病毒載體，通過轉染293A細胞進一步包裝了含有Lrrc10的腺病毒，將腺病毒轉染新生原代大鼠的心肌細胞，在苯腎上腺素（PE）和10%胎牛血清的刺激（FBS）48小時，通過心肌特異性抗體α－actin免疫熒光染色，在共聚焦顯微鏡下觀察，選取100個細胞，用SPOT軟件對其細胞表面積尺寸分析，發現Lrrc10過表達能顯著地抑制由PE?和10%FBS引起的心肌細胞尺寸變大，表明Lrrc10是一個新的心臟保護因子。