[發明專利]肽的生產和純化方法

無效

• 申請號: 201110100461.2
• 申請日: 2008-11-21
• 公開（公告）號: CN102241739A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 羅蘭·卡倫斯;喬治斯·布隆迪爾;蒂里·德爾普朗什
• 申請（專利權）人: 索爾維公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;韓宏星

本申請是專利申請CN.200880125208.9“肽的生產和純化方法”的分案申請，該母案申請是2008年11月21日提交的PCT申請PCT/EP2008/066037進入中國國家階段的申請。

技術領域

本發明涉及一種用于制備某一種八肽的方法并且特別涉及包括純化步驟的這樣一種方法。

背景技術

密閉帶毒素(“zot”)，(一種由霍亂弧菌生產的腸毒素)，通過可逆地影響緊密連接的結構增加滲透性的事實第一次描述于PCT/WO?9637196(馬里蘭大學(美國))中。它的序列與一種它的真核的人的類似物(zonulin)在它們推測的結合域(GXXXVGXG)中的比較發現了一種8氨基酸共享的基序，這由DI?PIERRO，et?al.Zonula?Occludens?Toxin?Structure-Function?Analysis.J.biol.chem.2001，vol.276，no.22，p.19160-19165描述。

具有以下序列的八肽(存在于zonulin中)：Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ?ID?NO?1)已被Fasano在PCT/WO?0007609(馬里蘭大學(美國))中和被WANG，et?al.Human?Zonulin，a?Potential?Modulator?of?Intestinal?Tight?Junctions.Journal?of?Cell?Science.2000，vol.113，p.4435-4440描述為連接到密閉帶毒素受體的zonulin的一種肽拮抗劑。Fasano披露了它在腸胃炎連同與血腦屏障的破壞相關的疾病的治療方法中的應用。Fasano等人還在US7,026,294B(馬里蘭大學(美國))中描述了其在延緩疾病發作的方法中的用途。

這種八肽在治療各種疾病的領域中看起來非常有希望，各種疾病包括細胞間通訊混亂，包括導致自身免疫性疾病(例如乳糜瀉和1型糖尿病)的發展和腸紊亂，組織炎癥，惡性轉化和轉移。上述參考沒有描述用于合成該八肽的任何方法。本發明現在可以得到一種用于它的制備的方法。

申請人在此描述了一種用于合成該八肽Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ?ID?NO?1)的方法，該方法可以高產率并且高品質純度水平有效地生產所述八肽，同時在生產率和所要求的制造設備上具有優點。

發明內容

合成Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ?ID?NO?1)

本發明涉及一種用于合成一種Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ?ID?NO?1)的方法，該方法包括至少一個在溶液中進行的肽偶聯步驟。

根據本發明的方法允許使用一種匯集合成策略，使用有限數量的步驟，并且避免逐個的保護/脫保護反應。

出人意料地發現根據本發明的該方法允許以工業規模提供所述八肽而基本上不產生副產物或沒有外消旋作用。而且，根據本發明的方法有可能形成的副產物通過特定的純化方法從最終的八肽中迅速地可分離。此外，本發明允許合成含有L-和D-氨基酸構型的肽。而且，已經發現根據本發明的方法的中間體和產物可以通過固/液分離技術例如沉淀或結晶容易地進行分離和純化。根據本發明的方法如果希望的話甚至可以基本上避免任何耗時的純化步驟例如色譜法。這在合成八肽的框架中是罕見的和料想不到的。

具體實施方式

在一個第一具體方面中，根據本發明的方法包括使具有下式的一種肽：

Val-Gln-Pro-Gly-Y(SEQ?ID?NO?2)；

其中C-端氨基酸被一種羧酸保護基團Y保護；

與一個亮氨酸或一個C-端亮氨酸肽進行偶聯，該亮氨酸或C-端亮氨酸肽優選選自式：

X-Gly-Gly-Val-Leu(SEQ?ID?NO?3)、X-Gly-Val-Leu和X-Val-Leu；并且其中所述亮氨酸或C-端亮氨酸肽可任選地被一種羧酸活化試劑活化。

該羧酸保護基團Y優選選自烷基酯類，芳基酯類，芳烷基酯類和甲硅烷基基團。Y更優選選自烷基酯類和甲硅烷基基團。用Val-Gln-Pro-Gly肽的烷基酯類且特別是用叔丁基酯得到優異的結果。