[發(fā)明專利]一種體外分離有核細(xì)胞且能去除紅細(xì)胞的方法和試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110097316.3
• 申請日: 2011-04-19
• 公開（公告）號: CN102747035A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 遲明國;蔡云松
• 申請（專利權(quán)）人: 北京同盛頤和生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.體外分離純化有核細(xì)胞且能去除紅細(xì)胞的試劑盒，包括各自隔離包裝的沉淀液、純化液、懸浮液和紅細(xì)胞裂解液，其中沉淀液是溶于生理鹽水的羥乙基淀粉，其重量體積濃度為6％，純化液是聚蔗糖泛影鈉，懸浮液是生理鹽水，紅細(xì)胞裂解液是7.47g/L的氯化銨+2.6g/L的三羥甲基氨基甲烷。

2.如權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的沉淀液、純化液、懸浮液和紅細(xì)胞裂解液和懸浮液各自獨(dú)立包裝。

3.如權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的沉淀液∶純化液∶懸浮液∶和紅細(xì)胞裂解液的體積比為(40-180)∶(60-180)∶20∶1。

4.如權(quán)利要求1-3的任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將經(jīng)過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘；

(2)用10ml的移液管將上清液轉(zhuǎn)到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細(xì)胞沉淀，并配平；

(3)將兩個(gè)離心管4℃，離心力710xg(2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細(xì)胞；

(4)將純化液按每管25ml加到另外兩個(gè)50ml新的離心管中，將第3步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4℃，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm)，20分鐘離心，關(guān)閉離心機(jī)剎車功能；

(5)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4℃，配平。離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm)，8分鐘離心洗滌細(xì)胞兩次；

(6)棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液輕輕吹打15～20s混勻；

(7)4℃，離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm)，8分鐘離心洗滌細(xì)胞三次；

(8)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。

5.如權(quán)利要求1-4的試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

(1)將經(jīng)過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘；

(2)用10ml的移液管將上清液轉(zhuǎn)到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細(xì)胞沉淀，并配平：

(3)將兩個(gè)離心管4℃，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細(xì)胞；

(4)將純化液按每管25ml加到另外兩個(gè)50ml新的離心管中，將第3步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4℃，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm)，20分鐘離心，關(guān)閉離心機(jī)剎車功能；

(5)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4℃，配平。離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm)，8分鐘離心洗滌細(xì)胞兩次；

(6)棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液輕輕吹打15～20s混勻；

(7)4℃，離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm)，8分鐘離心洗滌細(xì)胞三次；

(8)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。