[發明專利]一種轉基因番茄特異性檢測靶序列、質粒標準分子及其檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201110092368.1
• 申請日: 2011-04-13
• 公開（公告）號: CN102199599A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 周倫彬;胡良勇;周曉紅;麥榮嘉
• 申請（專利權）人: 廣州市計量檢測技術研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N1/21;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 秦雪梅;萬志香

技術領域

本發明屬于生物領域，主要涉及一種轉基因番茄Zeneca?B，Da，F品系的基因特異性和構建特異性的檢測靶序列、質粒標準分子及其核酸檢測試劑盒。

背景技術

自1996年全球第一例商品化的轉基因番茄問世以來，由GMCs加工的轉基因食品和食品成分達4000余種。隨著GMCs的大規模種植和商業化生產，其安全性問題受到廣泛關注。歐盟、韓國、日本等相繼制定了轉基因產品的標簽制度；我國于2001年開始實施標簽制度，2002年施行《農業轉基因生物標識管理辦法》，將玉米、大豆、油菜、棉花和番茄列為第一批實施標識管理的GMCs。轉基因番茄，一方面作為生物反應器，用以生產醫藥用重組蛋白、抗體的研發；另一方面，用于培育具有延熟、抗蟲等性能的的番茄良種品系。其中已商品化的轉基因番茄共有Zeneca?B，Da，F番茄、Bioscein(華番1號，商品名：百日鮮)等九種品系。目前，我國番茄轉基因成分的相關檢測技術研究較玉米、大豆等農作物略有滯后。在九種商品化的轉基因品系中只有Bioscein的檢測研究較為全面。我國國家質量監督檢驗檢疫總局2006年頒布了番茄中轉基因成分的定性PCR檢測方法行業標準(SN/T1816-2006)，而轉基因番茄的標準物質研究國內外尚未見報道。

轉基因番茄Zeneca?B，Da，F品系是由美國捷利康公司(Zeneca?Seeds)研發，于1994年在美國和1996年在加拿大批準上市。B，Da，F品系是利用根癌農桿菌介導轉化技術培育而成，目的基因是部分多聚半乳糖苷酶(polygalacturonase，pg)，可抑制番茄自身pg表達而具有延熟特性，便于儲藏和運輸。Da，F品系表達載體為pJR16S，內含部分正義的pg基因；B品系表達載體是pJR16A，內含部分反義的pg基因。實時熒光定量PCR(quantitative?real-time?PCR，qPCR)廣泛應用于轉基因產品的檢測。qPCR常通過對轉基因產品的標準物質(reference?material，RM)進行梯度稀釋，而構建檢測用標準曲線的方法來實現定量。基于拷貝數計算的qPCR定量，實驗證實質粒可以替代GMCs的基因組作為核酸標準物質。

在構建qPCR定量檢測體系中，RM用作陽性對照和配制不同濃度的定量檢測的標準品，用于對GMCs混合水平進行量化和分析。在轉基因定量檢測過程中，RM必須經過嚴格試驗驗證其均勻性、穩定性和定值。高純度、定值準確可靠、良好的溯源性和系列性是有證標準物質的特點。目前獲得歐盟IRMM(Institutefor?Reference?Materials?and?Measurements)認證以及應用的有證標準物質(certified?reference?material，CRM)的GMCs，如含量為0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的轉基因玉米Bt-176等，已不能滿足現階段快速增長的GMCs監控的需求。質粒容易獲得，儲存簡單，高穩定性以及普遍適用性等優點，實驗證實可以成為替代基因組的標準物質；質粒不僅操作簡單、定量簡單而且可以避免因為植物某些組織的基因結構不同而導致的轉基因含量的不一致。作為核酸標準物質，質粒標準分子插入的內標準基因與外源基因比例是恒定的，能夠應用于轉基因定量檢測。

2009年Reiting報道，GMCs亞麻品系CDC?Triffid?FP967(加拿大University?ofSaskatchewan)研發，于1996年在加拿大、1999年在美國批準生產及流通，在2001年退市。然而在2009年在檢測歐洲市場亞麻樣品中，CDC?Triffid亞麻FP967構建特異性呈陽性反應。這事件說明了盡管已退市的GMCs，其外源基因有可能發生基因的逃逸等情況而可能對生態安全性造成影響。所以，對退市或者未獲批準的轉基因作物，建立其國際標準化的檢測體系都是必需的。Roning等人在2003年根據轉基因玉米Bt11品系的表達載體序列設計特異引物，運用反向PCR技術擴增得到外源基因插入玉米基因在邊界序列，從而設計轉基因玉米Bt11品系特異性的引物和探針，同時獲得的序列與美國FDA在1995年對轉基因玉米Bt11品系品系的解除控制書中公布的表達載體的序列相吻合。Reiting根據GMCs數據庫AGBIOS針對CaMV35S啟動子和NPTII基因序列之間的連接區域序列設計特異性引物和探針，并能有效的檢測如轉基因玉米，轉基因棉花和轉基因油菜等不同品系GMCs。這些均證實GMCs中外源基因在成功導入作物基因組后，其導入序列是穩定，此也即我們能針對插入序列建立GMCs核酸檢測的重要科學基礎。