[發明專利]鲆鰈魚類五聯滅活疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201110092121.X
• 申請日: 2011-04-13
• 公開（公告）號: CN102166350A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 張正;王印庚;鄧楠楠;廖梅杰;王嵐;榮小軍;李彬
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: A61K39/116
• 分類號: A61K39/116;A61K39/39;A61P31/04;A61K39/106;A61K39/12
• 代理公司: 北京中偉智信專利商標代理事務所 11325
• 代理人: 張岱

技術領域：

本發明屬于海水魚類疫苗的制備技術，是通過增加疫苗中滅活的魚類病原菌種類和添加黃芪多糖來增強疫苗免疫效果的一種技術方法。

背景技術：

鲆鰈魚類是我國北方工廠化海水養殖的主要品種，對我國沿海地區的漁業經濟發展做出了重要貢獻。近幾年，隨著鲆鰈類養殖產業規模和產量的迅速擴大，疾病成為養殖生產面臨的主要問題之一。疾病頻繁的發生，對養殖的成活率形成直接威脅，造成的經濟損失已經在一定程度上制約了產業的健康平穩發展。

中國水產科學研究院黃海水產研究所已對我國的養殖鲆鰈類進行了全面、系統的疾病流行病學研究，發現了鲆鰈類20余種典型的疾病癥狀，并對它們的病原進行了細致、深入的研究。研究發現鲆鰈類的大多數疾病是由細菌性病原引起的，而鰻弧菌、大菱鲆弧菌、哈維氏弧菌、溶藻膠弧菌、遲鈍愛德華氏菌是鲆鰈類養殖過程中最為常見的五種病原菌，可以造成爛鰭、腹水、腸炎、紅體、肌肉膿腫等多種明顯的表觀癥狀。因為細菌性疾病是我國養殖鲆鰈類的主要疾病，廣大鲆鰈類養殖者在國內沒有商業化的鲆鰈類疫苗可用的情況下，主要依賴抗生素和化學類藥物來防御疾病。而長期使用抗生素，不僅容易使病原菌產生耐藥性，增加后續預防疾病的困難，而且其藥殘問題也關聯到養成商品魚的食品質量安全。因此，開發鲆鰈類養殖專用疫苗迫在眉睫。

通過注射疫苗來預防病原感染，是具有特異性免疫系統的動物行之有效的無公害疾病防治技術。這一技術方法在海水養殖魚類中同樣適用。在本發明作出之前，國內外有N.Castro等(Development?of?an?effective?Edwardsiella?tarda?vaccine?for?cultured?turbot?Scophthalmus?maximus.Fish?&?Shellfish?Immunology，Volume?25，Issue?3，September?2008)對大菱鲆的愛德華菌疫苗，曹宏梅等對鰻弧菌和溶藻弧菌二聯疫苗對大菱鲆的免疫效果(中國水產科學，2006年13卷第3期)，朱開玲等對大菱鲆的鰻弧菌滅活疫苗等方面展開了研究(高級技術通訊，2004年第2期)。他們的研究主要集中在用1種或2種大菱鲆的細菌病原制備疫苗，而且沒有使用黃芪多糖作為疫苗佐劑，與本發明相比，無論在疫苗組成還是疫苗功能上都存在明顯的不同。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題是提供一種鲆鰈魚類的五聯滅活疫苗，它具有多重的免疫效果，對鲆鰈魚類一次接種免疫后可以有效預防5種細菌性病原菌的感染，能夠顯著降低細菌性疾病的發病率。

本發明采用如下技術方案：

鲆鰈魚類的五聯滅活疫苗是由滅活的鰻弧菌、大菱鲆弧菌、哈維氏弧菌、溶藻膠弧菌、遲鈍愛德華氏菌的菌懸液等體積混合制成。

所述的鲆鰈魚類的五聯滅活疫苗，優選的由滅活的鰻弧菌、大菱鲆弧菌、哈維氏弧菌、溶藻膠弧菌、遲鈍愛德華氏菌的菌懸液和黃芪多糖溶液混合制成。

所述的鲆鰈魚類的五聯滅活疫苗，優選的各成份濃度為：鰻弧菌10⁸～10⁹cfu/mL，大菱鲆弧菌10⁸～10⁹cfu/mL，哈維氏弧菌10⁸～10⁹cfu/mL，溶藻膠弧菌10⁸～10⁹cfu/mL，遲鈍愛德華氏菌10⁸～10⁹cfu/mL，黃芪多糖7.5～17.5mg/mL。

本發明所要解決的另一技術問題是提供一種鲆鰈魚類的五聯滅活疫苗的制備方法。

本發明為解決上述技術問題，所采用的技術方案如下：

(1)將能夠感染鲆鰈類發病的鰻弧菌、大菱鲆弧菌、哈維氏弧菌、溶藻膠弧菌、遲鈍愛德華氏菌接種到胰蛋白胨大頭肉湯培養基(TSB)平板上，28℃培養24h-48h進行復蘇；

(2)分別挑取上述5株病原菌到TSB液體培養基中，28℃條件下110～120r/min的轉速振蕩培養24h，收集培養液在4℃條件下5000rpm離心5分鐘，將離心后的沉積菌體用pH＝7.2的PBS緩沖液(成份：NaCl?8.0g/L；KCl0.2g/L；Na₂HPO₄?1.15g/L；KH₂PO₄?0.2g/L，去離子水配制。)沖洗3遍后，用滅菌后的1.5％(重量比)的NaCl溶液分別制成10⁹～10¹⁰cfu/mL的菌懸液原液；