[發(fā)明專利]一種IVa2基因功能缺失的重組腺病毒載體及制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110088767.0
• 申請(qǐng)日: 2011-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN102732561A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳小兵;阮力;柳云帆;董小巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所;北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域?本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種IVa2基因功能缺失的新型重組腺病毒載體及其制備方法和用途。所述的重組腺病毒載體具有病毒基因組可復(fù)制而不產(chǎn)生子代病毒的特點(diǎn)。這種腺病毒載體在疫苗研究和基因治療中都有應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)背景?腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種雙鏈、無包膜的DNA病毒。完整的病毒顆粒為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑70-100nm。衣殼含有240個(gè)六聯(lián)體(Hexon)、12個(gè)五聯(lián)體(Penton)及12根纖毛(Fiber)，以及一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa等。在超過50種的腺病毒血清型中，Ad5常用作基因轉(zhuǎn)移的載體。哺乳動(dòng)物腺病毒的基因組DNA長約36kb，基因組的兩端各有約100的反向末端重復(fù)序列(Inverted?terminal?repeat，ITR)。ITR與末端蛋白(TP)相結(jié)合，與基因組復(fù)制以及早期基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

腺病毒的生活周期，以病毒基因組DNA的復(fù)制為節(jié)點(diǎn)，分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)。前者有E1A、E1B、E2、E3和E4共5個(gè)非連續(xù)的轉(zhuǎn)錄單位；晚期只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，受主要晚期啟動(dòng)子(Major?late?promoter，MLP)調(diào)控。晚期轉(zhuǎn)錄單位經(jīng)過mRNA的剪切加工，形成L1-L5共5種mRNA家族。所有的晚期轉(zhuǎn)錄mRNA的C末端都有一個(gè)共同的非翻譯前導(dǎo)序列，稱為三聯(lián)先導(dǎo)序列(Tripartite?leader，TPL)。TPL由腺病毒基因組的3個(gè)不同位置拼接而成，長203bp，與晚期mRNA的翻譯有關(guān)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)各區(qū)所編碼的蛋白均有所不同。E1基因編碼區(qū)是病毒復(fù)制的必需區(qū)，在病毒進(jìn)入細(xì)胞核后立即被活化，其編碼的蛋白(E1A和E1B)調(diào)節(jié)所有的早期功能。E2區(qū)基因產(chǎn)物分E2A(DBP)和E2B(pTP和Pol)，提供病毒DNA的復(fù)制機(jī)器。E3區(qū)是病毒復(fù)制的非必需區(qū)，編碼參與病毒與宿主相互作用的多肽，可減弱感染細(xì)胞被機(jī)體免疫識(shí)別的概率，刪去E3區(qū)對(duì)病毒感染沒有明顯的影響；E4區(qū)編碼關(guān)閉宿主基因表達(dá)，使其有利于病毒繁殖的蛋白質(zhì)，還可調(diào)節(jié)其他區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄。主要晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼組成衣殼的大部分蛋白質(zhì)，為病毒顆粒的裝配提供“建筑材料”。圖1為5型腺病毒的基因組的示意圖。

腺病毒載體因宿主范圍廣、外源基因表達(dá)水平高、不整合至染色體以及制備工藝成熟等特點(diǎn)而廣泛用于基因治療和疫苗研究^[1-2]。最為常用的腺病毒載體是E1缺失的復(fù)制缺陷性重組5型腺病毒，這種E1基因缺失的重組腺病毒能在HEK293細(xì)胞(含有并表達(dá)腺病毒E1基因)高效增殖，但在其它不表達(dá)腺病毒E1基因的細(xì)胞中則不復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒。雖然E1基因缺失所至的病毒復(fù)制缺陷很好地保證了腺病毒載體的安全性，但是對(duì)于疫苗載體而言，病毒載體基因組具有復(fù)制能力被證明能大大提高疫苗的免疫效果^[3]。因此，本案發(fā)明一種缺失腺病毒中期基因的載體，為最終建立一種保留病毒基因組復(fù)制能力而不能產(chǎn)生子代病毒的新型腺病毒載體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

E1基因是腺病毒生活周期中最早表達(dá)的調(diào)控基因，對(duì)于腺病毒基因組的復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)都是必需的。

IVa2基因的表達(dá)介于腺病毒生活周期中早期基因和晚期基因表達(dá)之間，因此被稱為中期基因(intermediate?gene)，也因?yàn)槠浔磉_(dá)緊接在早期基因之后而被稱為延遲的早期基因(delayed?early?gene)^[7]。IVa2是腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(major?late?promoter，MLP)的轉(zhuǎn)錄激活因子，對(duì)MLP的激活具有重要作用^[8，9]。而腺病毒的主要外殼蛋白Hexon，Penton，F(xiàn)iber等晚期蛋白的表達(dá)都受到MLP的調(diào)控。同時(shí)，IVa2在病毒外殼蛋白的裝配(assembly)以及病毒基因組入殼(encapsidation)過程中扮演了重要角色^[4]。因此，缺失IVa2基因的重組腺病毒，理論上在結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)以及病毒顆粒的裝配和基因組入殼過程受阻，從而不能產(chǎn)生子代病毒。

傳統(tǒng)上對(duì)病毒基因組的操作主要是通過體外分子克隆或者體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。對(duì)于長達(dá)200kb的痘苗病毒之類基因組較大的病毒進(jìn)行基因工程操作，大多數(shù)策略都是利用在病毒DNA在復(fù)制過程中天然發(fā)生的體內(nèi)同源重組來進(jìn)行的。但天然的同源重組效率相對(duì)較低，非重組子的本底過高，區(qū)分重組病毒和野病毒則是一件比較繁瑣的事情。