[發(fā)明專利]一種同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的方法無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201110086469.8 | 申請(qǐng)日： | 2011-04-07 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN102732510A | 公開（公告）日： | 2012-10-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 王恒樑;劉先凱;王東澍;王華貴;馮爾玲 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所 |
| 主分類號(hào)： | C12N15/11 | 分類號(hào)： | C12N15/11;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/09;A61K39/02;A61P31/04 |
| 代理公司： | 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245 | 代理人： | 關(guān)暢;任鳳華 |
| 地址： | 100071 北京市豐臺(tái)*** | 國(guó)省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 同時(shí) 驅(qū)除 炭疽 桿菌 毒力 質(zhì)粒 pxo1 pxo2 方法 | ||
1.一種DNA分子，為如下(1)或(2)或(3)
(1)序列表中序列1所示的DNA分子；
(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；
(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于：
所述重組載體為將權(quán)利要求1所述的DNA分子插入穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組載體，其特征在于：
所述穿梭質(zhì)粒為溫敏型穿梭質(zhì)粒，
所述溫敏型穿梭質(zhì)粒具體為pKSV7。
5.權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體在同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2中的應(yīng)用。
6.一種同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的方法，包括如下步驟：
將權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌，得到重組菌；將所述重組菌傳代培養(yǎng)，至所述重組菌中的炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2被驅(qū)除，得到同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的重組菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：
所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的方法中，在將權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌前，還包括將權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體去甲基化的步驟，
所述去甲基化的方法包括如下步驟：
1)、將權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體轉(zhuǎn)入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌1；
2)、提取步驟1)得到的所述重組菌1的質(zhì)粒，得到去甲基化的重組載體；
所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的方法中，在所述傳代培養(yǎng)后，還包括將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的重組菌去除權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體的步驟，
將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的重組菌去除權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體的方法包括如下步驟：
將所述同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的重組菌分別接種在無(wú)所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物培養(yǎng)基和含所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取在無(wú)所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物培養(yǎng)基生長(zhǎng)且在含所述重組載體抗性篩選標(biāo)記物的培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的菌，得到驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1、pXO2和所述重組載體的重組菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述出發(fā)菌為炭疽桿菌(Bacillus?anthracis)；
所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCS110；
所述抗性篩選標(biāo)記物為氯霉素；
所述傳代培養(yǎng)的溫度為不高于30℃，所述傳代培養(yǎng)的溫度具體為30℃；
所述將同時(shí)驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的重組菌去除權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體的方法中，所述培養(yǎng)溫度為37℃-42℃，所述培養(yǎng)溫度具體為37℃。
9.由權(quán)利要求6-8中任一所述方法制備的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1、pXO2和所述重組載體的重組菌。
10.權(quán)利要求1所述的DNA分子、權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體、權(quán)利要求9所述的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1、pXO2和所述重組載體的重組菌在制備疫苗中的應(yīng)用；所述疫苗具體為炭疽疫苗；
一種炭疽疫苗，其活性成分為權(quán)利要求9所述的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1和pXO2的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1、pXO2和所述重組載體的重組菌。
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