[發(fā)明專利]一種實時熒光定量RT-PCR檢測FMDV的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110084991.2
• 申請日: 2011-04-06
• 公開（公告）號: CN102220436A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設計）人: 羅寶正;王振全;薄清如;沙才華;徐海聶;廖秀云;陳偉生;李紅星
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭

技術領域

本發(fā)明涉及檢測技術領域，特別涉及一種可以精確、特異、快速檢測口蹄疫病毒群特異性、O型特異性、AsiaⅠ特異性的方法。?

背景技術

口蹄疫(Foot?and?mouth?disease，F(xiàn)MD)是由FMDV（Foot?and?mouth?disease?virus）感染引起的偶蹄動物共患的急性、熱性和接觸性傳染病。由于該病發(fā)病迅速，傳染性較強可能帶來嚴重的影響，因此世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類疫病。該病一經檢出，相應的家畜及畜產品就禁止運輸和出口，造成巨大的經濟和政治影響。我國于2005年對外公布了AsiaⅠ型FMD?疫情，加上以前報道FMD，已經有2個血清型的口蹄疫疫情在國內出現(xiàn)過。FMD?的爆發(fā)和流行除了對畜牧業(yè)生產造成巨大的損失外，對人民生活所需要的奶品、肉品供應也造成很大的影響，故各國對?FMD的檢驗檢疫非常嚴格。?

目前對于口蹄疫病毒的檢測方法主要有：病毒分離、補體結合實驗（CFT）、病毒中和試驗（VNT）、動物接種試驗及ELISA方法。這些方法操作起來過程繁瑣且需時較長，特異性和靈敏度也無法滿足目前檢測需要。在病毒分離試驗中培養(yǎng)細胞過程尤為細心謹慎以控制污染，而且病毒材料的致病力以及對于細胞適應性有區(qū)別，細菌和霉形體也會對細胞造成污染，因此獲得的實驗結果往往出現(xiàn)差異。?

因此，現(xiàn)有技術還有待于改進和發(fā)展。?

發(fā)明內容

鑒于上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種實時熒光定量RT-PCR檢測FMDV的方法，旨在解決現(xiàn)有技術中所存在的問題。?

本發(fā)明的技術方案如下：?

一種用于實時熒光定量RT-PCR檢測FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特異性引物，其中，F(xiàn)MDV群特異性引物序列如SEQ?NO.1-2所示；FMDV?O型特異性引物序列如SEQ?NO.4-5所示；FMDV?AsiaⅠ型特異性引物序列如SEQ?NO.7-8所示。

一種用于實時熒光定量RT-PCR檢測FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特異性探針，其中，F(xiàn)MDV群特異性探針序列如SEQ?NO.3所示；FMDV?O型特異性探針序列如SEQ?NO.6所示；FMDV?AsiaⅠ型特異性探針序列如SEQ?NO.9所示。?

所述的用于實時熒光定量RT-PCR檢測FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特異性探針，其中，所述FMDV群特異性探針、FMDV?O型特異性探針和FMDV?AsiaⅠ型特異性探針的5'端都標記發(fā)光基團FAM，3'端都標記泯滅基團TAMRA。?

一種使用上述的特異性引物和特異性探針的實時熒光定量RT-PCR檢測FMDV的方法，其中，包括以下步驟：?

S100、樣品的預處理：對采集的樣品分別編號進行編號，分別取少量的樣品混合青、鏈霉素雙抗溶液，勻漿，取上清，4℃過夜；

S200、RNA提取：對采集的樣品提取RNA；

S300、FMDV實時熒光定量RT-PCR擴增：以上述步驟所提取的RNA為模板，分別使用FMDV群、O型、AsiaⅠ型的特異性引物、特異性探針進行PCR擴增；

S400、根據實時熒光定量RT-PCR反應結果鑒定診斷是否含有FMDV，并判斷是否為O型或AsiaⅠ型FMDV。

所述的實時熒光定量RT-PCR檢測FMDV的方法，其中，所述步驟S300中的實時熒光定量RT-PCR反應體系為25?μL：2×1?Step?Buffer?12.5?μL，10?μmol/L上、下游特異性引物和特異性探針各1.0?μL，PrimeScript?1?Step?Enzyme?Mix：1.0?μL，RNA模板2.5?μL，RNase?Free?H₂O?6.0μL；?

反應條件為42℃?30?min，92℃??2min，92℃?10?s，55℃?30?s，40個循環(huán)。

有益效果：本發(fā)明利用實時熒光定量RT-PCR技術可以對FMDV進行種屬性、O型和AsiaⅠ型的檢測。經過對本發(fā)明所建立的方法進行了特異性、靈敏度的驗證，結果顯示可以較好的將FMDV同偶蹄目其他易感病毒以及O型和AsiaⅠ型區(qū)分開，且靈敏度可以達到10個拷貝數(shù)的模板用量。同傳統(tǒng)病毒分離實驗相比較，如果針對分離的FMDV不適應細胞培養(yǎng)時，本發(fā)明方法更加顯示出其優(yōu)越性，而且需要極少的樣品即可檢測。另外，本發(fā)明所建立的方法整個反應過程是閉管操作，在最大程度上減少了體系的污染。從獲得待檢樣品到提取核酸，配制熒光定量RT-PCR反應體系，直到出現(xiàn)反應結果，整個過程可以在2.5h內完成，在保證檢驗結果的基礎上大大縮短了檢驗所需時間。?