[發(fā)明專利]一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法和抗體芯片

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110082521.2
• 申請日: 2011-04-01
• 公開（公告）號: CN102735836A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設計）人: 劉箐;熊亮斌
• 申請（專利權）人: 上海慧耘生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體為植物病原的檢測方法和試劑，尤其是可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法和抗體芯片。

背景技術

植物病害分為侵染性和非侵染性兩類，其中侵染性病害又主要可分為真菌性、細菌性、病毒性和線蟲性等。植物病害種類繁多、傳播途徑廣，可破壞或干擾植物正常的生理機能，且目前缺少有效防治措施，使得許多重要的病毒病、細菌病一旦流行，便很難控制，是導致蔬菜、花卉產(chǎn)量和品質下降最重要的原因之一。

目前對植物病害的檢測方法主要有生物學檢測、電子顯微鏡觀察、血清學檢測和分子生物學方法等(Direct-PCR、免疫-PCR、RT-PCR等)。生物學檢測又稱指示植物檢測法，該方法是將某種病毒接種特定的指示植物，根據(jù)指示植物表現(xiàn)出的局部或系統(tǒng)癥狀，初步判定病毒的種類和歸屬。電子顯微鏡技術可直接觀察到病害的形態(tài)結構、存在與否等信息，是最直接、最準確的病原檢測手段。血清學檢測，主要是利用抗原抗體可特異性結合的原理，利用病原的特異性抗體來檢測鑒定病原。分子生物學檢測方法主要有核酸分子雜交技術、dsRNA電泳技術、PCR技術等，這些方法均可快速、靈敏、特異性的檢測病原。

但以上這些比較通用的植物病害檢測方法，都或多或少存在著缺陷：生物學檢測一般需在溫室中進行，全檢測過程耗時較長；電子顯微鏡觀察一般需負染色或制作超薄切片，且檢測鑒定過程需在電子顯微鏡下進行；ELISA等血清學方法其檢測時間較長，且每個反應孔只可單獨檢測一種病原，在需篩選大量樣品或單個樣品的多個病原項目時，工作量往往相當龐大，具有耗時、費力的缺點；分子生物學方法需要標記探針分子(核酸分子雜交技術)，或提取核酸后進一步將mRNA反轉錄成cDNA(RC-PCR)，檢測過程中目標核酸損失較大，檢測結果因為核酸雜交或擴增過程易受植物成分的抑制而出現(xiàn)假陰性結果。

蛋白質芯片是近些年發(fā)展起來的一項新技術，又稱蛋白質陣列或蛋白質微陣列，最早由德國科學家Angelika?Lueking于1995年開始研究，主要利用抗原與抗體、受體與配體間可特異性結合的原理，將探針分子固定在載體表面，用于分析被檢樣品液中目的分子信息的技術。蛋白質芯片誕生初期主要被用于蛋白質組學研究，隨后被逐漸推廣至生物醫(yī)學相關領域，而將蛋白質芯片(抗體芯片)用于植物病原的檢測，國內外目前仍未見相關報道。蛋白質芯片用于植物病原的快速檢測，具有節(jié)約時間、節(jié)省抗體、靈敏度高、重復性好等眾多優(yōu)點，檢測結果既可用肉眼直接判定，也可通過分析灰度后作定量檢測，推廣應用前景廣闊。

發(fā)明內容

本發(fā)明旨在提供一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法。

本發(fā)明還提供了可視化快速聯(lián)檢植物病原的抗體芯片。。

一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法，包括以下步驟：

(1)將檢測樣品與抗體芯片雜交孵育1～5hr；所述的抗體芯片包括固定在基膜上的植物病原捕獲抗體；

(2)洗滌后再加入相應的植物病原檢測抗體雜交孵育，繼續(xù)反應1～5hr；

(3)洗滌后顯色。

所用的植物病原捕獲抗體分別為番茄細菌性潰瘍病菌(Corynebacterium?michiganense?pv.Michiganense，Cmm)、黃瓜花葉病毒(CuCumber?mosaic?virus，CMV)、鳳果花葉病毒(Pepino?mosaic?virus，PepMV)、番茄不孕病毒(Tomato?aspermy?virus，TAV)、番茄黑環(huán)病毒(Tomato?black?ring?virus，TBRV)、番茄花葉病毒(Tomato?mosaic?virus，ToMV)、番茄環(huán)斑病毒(Tomato?ring?spot?virus，ToRSV)、煙草環(huán)斑病毒(Tobacco?ringspot?virus，TRSV)、煙草脆裂病毒(Tobacco?rattle?virus，TRV)和番茄斑萎病毒(Tomato?spotted?wild?virus，TSWV)捕獲抗體中的至少一種。

以IgG為質控對照。

用pH＝7.2～7.4、吐溫-20質量含量0.01％～0.1％的磷酸鹽緩沖液洗滌。

用pH＝7.2～7.4、吐溫-20質量含量0.01％～0.1％、BSA質量含量0.1％～0.5％的磷酸鹽緩沖液稀釋檢測抗體。

檢測抗體的標記物為堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或生物素等。

堿性磷酸酶的顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽和四唑硝基藍；辣根過氧化物酶的顯色底物為二氨基聯(lián)苯胺；標記物為生物素時先加入親和素-納米金，再用銀染色。