[發(fā)明專利]一種檢測(cè)植物中目標(biāo)蛋白的方法及其專用SPR生物傳感器

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110081230.1
• 申請(qǐng)日: 2011-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN102156193A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 麻密;徐文忠;趙卓亞;何振艷;申紅玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院植物研究所
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)植物中目標(biāo)蛋白的方法及其專用SPR生物傳感器。

背景技術(shù)

隨著轉(zhuǎn)基因植物以及產(chǎn)品的安全性問題日益受到關(guān)注，建立準(zhǔn)確、可靠、便捷的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)和檢測(cè)平臺(tái)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物商品化的檢測(cè)非常重要。表面等離子共振(Surface?plasmon?resonance，SPR)生物傳感器是近年來國際上迅速發(fā)展的光學(xué)生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù)。SPR生物傳感器是將探針或配體固定于傳感器芯片的金膜表面形成單分子層，當(dāng)含有能與之作用的分析物的液體流經(jīng)傳感片表面時(shí)，分子間發(fā)生特異性結(jié)合并可引起傳感片表面折射率的改變，通過檢測(cè)SPR信號(hào)改變而監(jiān)測(cè)分子間的相互作用。SPR生物傳感器具有無需標(biāo)記、靈敏準(zhǔn)確、快速、能夠?qū)崿F(xiàn)在線連續(xù)以及高通量等檢測(cè)特點(diǎn)，特別適合于生物分子之間相互作用，通過傳感器芯片實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各類生物分子如多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖和小分子信號(hào)物質(zhì)之間相互作用的整個(gè)過程，并通過分析軟件可以測(cè)定溶液中與固定相作用的物質(zhì)的量。

目前通過檢測(cè)目標(biāo)蛋白鑒定轉(zhuǎn)基因植物的常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked?immunosor-bent?assay，ELISA)，ELISA具備了酶反應(yīng)的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的特異性，具有簡(jiǎn)便、快速，費(fèi)用低等特點(diǎn)。歐盟13個(gè)國家38個(gè)實(shí)驗(yàn)室用ELISA對(duì)轉(zhuǎn)基因成分為2％的RR大豆樣品中的EPSPS進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確率高達(dá)99％，檢測(cè)限為0.35％。但易出現(xiàn)本底過高的問題，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，且只能檢測(cè)未加工產(chǎn)品，并且只能檢測(cè)有限種類的轉(zhuǎn)基因生物。Western?blot是植物基因工程中檢測(cè)外源基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)的權(quán)威方法，具有很高的靈敏性，但其操作較繁瑣，費(fèi)用較高，不適于快速、大量樣品的檢測(cè)。而SPR檢測(cè)在蛋白檢測(cè)方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：快速簡(jiǎn)便，實(shí)時(shí)檢測(cè)，樣品無需標(biāo)記，高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面有相當(dāng)大的發(fā)展?jié)摿Γ壳巴ㄟ^SPR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中是否含有目標(biāo)蛋白的研究尚未見報(bào)道。

例：蘇云金桿菌(Bacillus?thuringiensis，Bt)毒蛋白基因是目前世界范圍內(nèi)使用最廣泛的抗蟲基因，Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在我國的栽植面積逐年增加，有數(shù)據(jù)顯示，河北省今年栽植的棉花中90％為抗蟲棉品種，然而抗蟲棉可能會(huì)像其他的轉(zhuǎn)基因作物一樣帶來一些問題，諸如昆蟲抗蟲性增強(qiáng)，天敵數(shù)量減少，基因漂流，生物多樣性被破壞等等，因此，對(duì)Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)是非常必要的。

據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了60群Bt殺蟲晶體蛋白基因，根據(jù)它們殺蟲范圍和基因序列的同源性不同可粗分為六大類(CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryV、Cyt)每一類中又可分為許多亞類，目前轉(zhuǎn)入棉花的有CryIAc、CryIAb、CryIAc和CryIAb融合基因等幾種對(duì)鱗翅目害蟲有較強(qiáng)的抗性的Bt殺蟲晶體蛋白基因。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種SPR生物傳感器在輔助檢測(cè)生物目標(biāo)蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種如下所述SPR生物傳感器在輔助檢測(cè)生物目標(biāo)蛋白中的應(yīng)用。

所述生物為植物；所述目標(biāo)蛋白為抗蟲蛋白。

所述植物為轉(zhuǎn)入所述目標(biāo)蛋白的編碼基因的植物。

所述抗蟲蛋白為Cry1Ac蛋白。

所述Cry1Ac蛋白為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。

所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

所述Cry1Ac蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)所示的基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；

3)與1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。

所述嚴(yán)格條件可為在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于輔助檢測(cè)待測(cè)生物中目標(biāo)蛋白的SPR生物傳感器。

本發(fā)明提供的一種用于輔助檢測(cè)待測(cè)生物中目標(biāo)蛋白的SPR生物傳感器，為將抗目標(biāo)蛋白抗體以共價(jià)結(jié)合的方式偶聯(lián)到傳感芯片上，得到的SPR生物傳感器。

所述抗目標(biāo)蛋白抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；