[發明專利]人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法

無效

• 申請號: 201110075335.6
• 申請日: 2011-03-28
• 公開（公告）號: CN102199198A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 何金生;鄭妍鵬;唐亞寧;付遠輝
• 申請（專利權）人: 北京交通大學
• 主分類號: C07K14/135
• 分類號: C07K14/135;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 張文祎

1.一種人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）細胞與病毒培養：將HEp-2細胞或Vero細胞培養于含有血清的DMEM培養基中，待細胞豐度為80%~90%時，接種人呼吸道合胞病毒，然后更換含血清的DMEM培養基繼續培養細胞，細胞出現完全病變后收集細胞及培養基，離心，收集上清作為病毒貯液；

（2）病毒的濃縮與純化：所述病毒貯液利用聚乙二醇沉淀法進行濃縮，然后通過蔗糖密度梯度離心進一步純化，得到病毒混懸液；

（3）病毒的裂解：向所述病毒混懸液中加入病毒裂解液，4℃裂解20~30min，然后加入緩沖液A稀釋3~5倍，離心，取上清，得到病毒蛋白粗提液；

其中，所述病毒混懸液與病毒裂解液的體積比為1:5~1:10，所述病毒裂解液為含有250?mM?蔗糖，25?mM?MES-NaOH，10?mM?NaCl，0.5%?Triton?X-100，2mM?EDTA，1?mM?PMSF，pH?5.7的溶液；所述緩沖液A為含有25?mM?MES-NaOH，0.03%?Triton?X-100和10?mM?NaCl，pH?5.7的溶液；

（4）離子交換柱層析純化：采用陰離子交換層析柱，先用緩沖液A平衡柱子，之后上樣病毒蛋白粗提溶液，經2倍柱體積緩沖液A清洗后，采用緩沖液A和緩沖液B混合緩沖液，進行線性梯度洗脫，梯度洗脫過程中，混合緩沖液中緩沖液B的含量從0線性遞增至100%，洗脫5~15個柱體積，收集穿透峰和各洗脫峰，進行SDS-PAGE和Western?Blot分析檢測，得到陽性洗脫組分，

其中所述緩沖液B為含有25?mM?MES-NaOH，0.03%?Triton?X-100，1M?NaCl，pH?5.7的溶液；

（5）凝膠過濾柱層析純化：采用凝膠過濾層析柱，先用緩沖液C平衡柱子，上樣經離子交換層析柱得到的陽性洗脫組分，然后用緩沖液C洗脫，收集各洗脫峰，進行SDS-PAGE和Western?Blot分析檢測，得到陽性洗脫液，然后將該洗脫液凍干，即得；

其中，所述緩沖液C為含有25?mM?MES-NaOH，0.03%?Triton?X-100，150?mM?NaCl，pH?5.7的溶液。

2.根據權利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟（1）中，接種人呼吸道合胞病毒的量為MOI=0.005~0.20。

3.根據權利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟（2）中，所述病毒濃縮的具體方法為：向所述病毒貯液中加入MgSO₄溶液和pH7.0~8.0的HEPES溶液，至該混合溶液中MgSO₄的終濃度為0.1~0.2?M，HEPES的終濃度為50~100mM，然后用50%?PEG6000滴加入到該混合溶液中，滴加至PEG6000的體積百分含量為10%時停止滴加，在4℃攪拌90?min，然后在5800-6000rpm條件下，離心20?min，棄上清，按沉淀量的1~5%的量加預冷NTE溶液溶解，并且向該溶液中加入MgSO₄溶液和EDTA溶液，至該溶液中所述MgSO₄的終濃度為0.1~0.2M，EDTA的終濃度為1~2mM，得到溶解的病毒液；

其中，所述NTE溶液為含有150?mM?NaCl，50?mM?Tris-HCl，1mM?EDTA，pH?7.5的溶液。

4.根據權利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟（2）中，所述病毒純化的具體方法為：依次將2mL?60%、2mL?45%及2mL?30%蔗糖溶液由下至上放入離心管中，所述溶解的病毒液置于最上層，35000rpm，4℃離心90min，收集病毒帶，然后用NTE溶液稀釋3~5倍后，22000rpm，4℃離心90min，收集沉淀，用NTE溶液溶解后，得到病毒混懸液；

其中，所述NTE溶液為含有150?mM?NaCl，50?mM?Tris-HCl，1mM?EDTA，pH?7.5的溶液。

5.根據權利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟（4）中，所述陰離子交換層析柱為Hitrap?Q?FF、Hitrap?Q?HP、Hitrap?DEAE?FF。

6.根據權利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的純化方法，其特征在于，步驟（5）中，所述凝膠過濾層析柱的填料為Sephacryl?S-300，Sephacryl?S-400，Sepharose?6B，?Sepharose?CL-6B，Superdex?200，Superose?6。