[發(fā)明專利]人膜聯(lián)蛋白V變體及其表達、制備和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110072451.2
• 申請日: 2011-03-24
• 公開（公告）號: CN102690345A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發(fā)明（設計）人: 華子春;胡敏進
• 申請（專利權）人: 江蘇靶標生物醫(yī)藥研究所有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;G01N33/58;A61K51/08;A61K103/10
• 代理公司: 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 金輝

1.一種膜聯(lián)蛋白V變體，具有序列表中序列1氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其特征在于：是序列1中的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與序列1的氨基酸殘基序列相同活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

2.根據(jù)權利要求1所述的膜聯(lián)蛋白V變體，其特征是在膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加一段具有柔性結(jié)構(gòu)的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽為1-25氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成，并含有1-3個半胱氨酸。

3.根據(jù)權利要求1所述的膜聯(lián)蛋白V變體，其特征在于膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加一個半胱氨酸。

4.一種上述膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，其特征在于：按如下步驟進行：

a.利用計算機輔助分子設計，在膜聯(lián)蛋白V晶體結(jié)構(gòu)的基礎上，對膜聯(lián)蛋白V的C-末端添加氨基酸序列進行分子模建和設計；

b.設計膜聯(lián)蛋白V蛋白編碼序列的引物對，以膜聯(lián)蛋白V基因為模板進行PCR擴增；

c.PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10上進行培養(yǎng)；

d.用限制性內(nèi)切酶Nco?I和Xho?I分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達載體pET28a，將得到的兩種目的基因片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10進行培養(yǎng)并篩選提取重組表達質(zhì)粒；

e.將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達宿主菌內(nèi)，培養(yǎng)菌株得菌液，用IPTG誘導菌液，收集菌種；

f.將步驟e獲得的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體；

g.將菌體破碎、裂解、純化，收集純化后的蛋白。

5.根據(jù)權利要求4所述的膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，其特征在于：所述引物對的核苷酸序列為：

上游引物：5’-gtt?cca?tgg?gcg?cac?agg?ttc?tca?gag?gca-3’；

下游引物：5’-tcc?gct?cga?gtt?agc?agt?cat?ctt?ctc?cac?aga?gca-3’。

6.根據(jù)權利要求4所述的膜聯(lián)蛋白V變體的制備方法，其特征在于：步驟g中純化的步驟依次為沉淀解吸、硫酸銨分級沉淀、Super?Q-650M層析和SP層析。

7.根據(jù)權利要求4所述的膜聯(lián)蛋白V變體作為細胞凋亡探針的制備方法，其特征在于：進行熒光化學標記或者核素標記。

8.根據(jù)權利要求7所述的膜聯(lián)蛋白V變體作為細胞凋亡探針的應用，其特征在于：在制備細胞凋亡監(jiān)測試劑、疾病監(jiān)測藥物中的應用。