[發明專利]利用RT-LAMP方法快速檢測飛虱體內水稻黑條矮縮病毒

有效

• 申請號: 201110071930.2
• 申請日: 2011-03-24
• 公開（公告）號: CN102168151A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 周彤;周益軍;杜琳琳;蘭瑩;徐秋芳;孫楓;范永堅
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
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技術領域

本發明涉及飛虱體內水稻黑條矮縮病毒的快速檢測技術及其在病害診斷和測報上的應用，屬于農業科學技術領域。

背景技術

水稻黑條矮縮病毒(Rice?black-streaked?dwarf?virus，RBSDV)，是水稻上一種危害嚴重的病毒病，隸屬于植物呼腸孤病毒科斐濟病毒屬(Fijivirus)，病毒粒體球狀，主要由灰飛虱傳播，田間癥狀前期主要表現為植矮縮，葉片濃綠，后期在葉片、葉鞘及莖桿上出現蠟滴狀突起，而后形成黑條，對水稻的產量影響很大，重病田甚至可導致無產量。該病毒除侵染水稻外，還可侵染玉米(玉米粗縮病)、小麥(小麥綠矮)及多種禾本科雜草。1963和1966年在中國江蘇、上海、浙江一帶流行，90年代在我國許多玉米和水稻產區爆發流行，造成了嚴重損失。近年來該病在江浙地區蔓延發生，且呈日漸嚴重的趨勢，2008年僅江蘇省發病面積就達400萬畝，致使當地的水稻生產損失嚴重。

2007年以來在廣東和海南等省新發生一種水稻病毒病，田間癥狀與水稻黑條矮縮病毒極其相似，對其基因組序列進行測定后發現其與水稻黑條矮縮病毒存在較大差異(兩者的S9和S10片段的同源性僅僅為75％和80％)，定名為南方水稻黑條矮縮病毒(Southern?rice?black-streaked?dwarf?virus，SRBSDV)，該病毒也屬于植物呼腸孤病毒科斐濟病毒屬(Fijivirus)，病毒粒體球狀，基因組由10條雙鏈RNA組成，傳播介體主要為白背飛虱，灰飛虱也可傳播，田間癥狀表現為植株矮縮、葉色深綠、葉背及莖稈出現條狀乳白色或深褐色小突起，寄主除水稻外還包括玉米及多種雜草。近年來該病長江下游地區蔓延發生，且呈日漸嚴重的趨勢，2009年南方水稻黑條矮縮病毒全國發生面積達300萬畝，2010年迅速上升至1900萬畝，僅湖南省就發生近1000萬畝，絕收面積8萬畝，給水稻生產帶來了巨大的損失。

由于兩種病毒在癥狀、粒體形狀、傳播介體及寄主等方面非常相似，由此也給其診斷及鑒定造成了困難。目前在植物病毒鑒定識別上常采用的方法有：生物學接種實驗，血清學檢測，電鏡觀察及分子生物學檢測。由于這兩種病毒的在很多方面都具有非常接近的特性，因此傳統的植物病毒檢測方法，如電鏡觀察(病毒粒子大小形狀相近)、傳統的生物學接種鑒定(癥狀、介體、寄主范圍相近)、血清學檢測(序列仍有較高的同源性)等方法都很難區分。環介導恒溫核酸擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)，是由Notomi?T等在2000年發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，它是一種高靈敏的鏈置換技術，一種新型的PCR替代技術。LAMP特點是針對靶基因的6個區域設計了4個特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶——Bst(Bacilluss?tearothermophilus)DNA?polymerase在恒溫(65℃)的條件下反應1小時即可完成核酸擴增反應，通過熒光染色直接目測比色就可以得到清晰的反應結果。不需要長時間的溫度循環，不需要PCR等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。目前已廣泛應用于人類和動植物各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷。

發明內容

本發明提供了一種快速檢測飛虱體內水稻黑條矮縮病毒的方法，通過該方法可以快速診斷出飛虱是否攜帶水稻黑條矮縮病毒。

本發明所提供的一種快速檢測植株上水稻黑條矮縮病毒的方法，是通過以下方法獲得的：

1)根據NCBI已報道的水稻黑條矮縮病毒S10核苷酸序列，通過軟件DNAstar分析后選擇相對保守區域950-1467bp，利用AY050488.1上的對應區域通過在線LAMP引物設計軟件primerExplorer?V4設計4條引物，其中包括2條外引物F3/B3和2條內引物FIP/BIP。

2)Trizol?reagent法提取植株總RNA；

3)設置不同內外引物濃度比例、Mg²⁺濃度，確定最佳反應體系；分別改變反應時間和溫度進行RT-LAMP擴增反應，確定最佳反應條件。

4)在最佳反應參數條件下，以南方水稻黑條矮縮病毒為對照驗證這一方法的特異性；

5)與RT-PCR方法進行比較，驗證RT-LAMP的可靠性；

6)通過肉眼判斷和SYBR?GreenI染色對RT-LAMP產物進行可視化處理。

本發明提供的引物序列如下：

F?3GGTACTTCTACTTCTAGTCCTT

B?3CTTTTTTCATGTCCATCAACTT