[發明專利]多樣本混合測序方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201110067314.X
• 申請日: 2011-03-17
• 公開（公告）號: CN102181533A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 周代星;張建光;高揚;王珺;劉卿
• 申請（專利權）人: 北京貝瑞和康生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 吳貴明

1.一種制備多樣品DNA混合測序文庫的方法，包括：

a)將一種樣品DNA鏈片段化成長度為數百個堿基的DNA片段；

b)分別在所述DNA片段的兩端連接上Y型接頭；

c)對兩端連接上Y型接頭的所述DNA片段進行PCR擴增；

d)根據上機測序通道的安排以及標簽序列的不同將多種經過步驟a)、b)和c)處理的樣品DNA混合；

其中，所述Y型接頭中包括了區別不同樣品的標簽序列，用于所述PCR擴增的第一引物和用于所述PCR擴增的第二引物除了與所述Y型接頭互補的序列外，還分別包括與第二代測序平臺中的兩種表面引物互補的序列，以用于在測序過程中使擴增得到的DNA片段與所述表面引物能夠互補雜交。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述標簽序列存在于距離所述Y型接頭的雙鏈區域末端6-10個堿基的雙鏈區。

3.一種利用第二代測序平臺同時測試多樣品DNA的方法，包括：

通過權利要求1或2的方法制備多樣品DNA混合測序文庫；

將所述多樣品DNA混合測序文庫上機檢測。

4.根據權利要求3所述的方法，其中，待檢測的DNA序列首先與第一端測序引物雜交讀取待測DNA片段的第一條鏈，然后與標簽序列引物雜交讀取標簽序列，最后與第二端測序引物雜交讀取所述待測DNA片段的第二條鏈。

5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述第一端測序引物讀到的第一個堿基為所述待測DNA片段一端的第一個堿基，所述標簽引物讀到的第一個堿基為所述標簽序列，所述第二端測序引物讀到的第一個堿基為所述待測DNA片段另一端的第一個堿基。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其中，所述第一端測序引物與所述標簽序列不完全堿基配對。

7.根據權利要求4或5所述的方法，其中，所述第二端測序引物與反向標簽序列不完全堿基配對。

8.根據權利要求4或5所述的方法，其中，不包括對待測DNA片段的第二條鏈測序的過程。

9.根據權利要求6所述的方法，其中，不包括對待測DNA片段的第二條鏈測序的過程。

10.一種制備多樣品DNA混合測序文庫的試劑盒，包括：

對片段化的DNA末端進行修復的酶和對DNA末端進行5’端磷酸化的酶；

在DNA的3’端加上腺嘌呤的酶和d?ATP；

將Y型接頭與DNA連接的酶；

適用于各種酶的緩沖液；

一組Y型接頭混合物；

用于PCR擴增的第一引物和第二引物；

dNTP混合液；

其中，所述Y型接頭上包括標簽序列，一種來源的DNA片段用包括一種特定標簽序列的Y型接頭，不同來源的DNA片段分別對應不同的標簽序列，所述第一引物和所述第二引物除了與所述Y型接頭互補的序列外，還分別包括與第二代測序平臺中的兩種表面引物互補的序列，以用于在測序過程中使擴增得到的DNA片段與所述表面引物能夠互補雜交。

11.根據權利要求10所述的試劑盒，進一步包括：

第一端測序引物、第二端測序引物和標簽測序引物，其中，第一端測序引物讀到的第一個堿基為所述待測DNA片段一端的第一個堿基，所述標簽引物讀到的第一個堿基為所述標簽序列，所述第二端測序引物讀到的第一個堿基為所述待測DNA片段另一端的第一個堿基。

12.根據權利要求11所述的試劑盒，其中，所述第一端測序引物與所述標簽序列不完全堿基配對。

13.根據權利要求11所述的試劑盒，其中，所述第二端測序引物與所述標簽序列不完全堿基配對。

14.根據權利要求11或13所述的試劑盒，其中，不包括所述第二端測序引物。