[發明專利]一種檢測手足口病病原的納米探針芯片及其應用方法

有效

• 申請號: 201110067159.1
• 申請日: 2011-03-20
• 公開（公告）號: CN102279172A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 亓立峰
• 申請（專利權）人: 亓立峰
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 趙芳;徐關壽

技術領域

本發明涉及一種病原檢測納米探針芯片，特別是涉及特異檢測手足口病病原的納米探針芯片技術及其應用。

背景技術

手足口病(hand-foot?mouth?disease，HFMD)是由腸道病毒引起的傳染病，多發生于嬰幼兒，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，個別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等并發癥。引發手足口病的腸道病毒有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型均為手足口病較常見的病原體，其中以柯薩奇病毒A16型(CoxA16)和腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)最為常見，而且發病死亡的患兒中主要是因為感染了EV71病毒。EV71是小RNA病毒科，腸道病毒屬成員。病毒基因組為7408個核苷酸(SHZH98)的單股正鏈RNA。近年來，EV71引起的手足口病重癥和死亡病例增長迅速。截至5月4日，全國已累計報告手足口病病例427278例，同比上升超40％，其中死亡260例，同比上升142.99％。國內目前95％以上的手足口患兒都是由EV71病毒引起的，表現為危重型癥狀，重癥患兒的病死率更是高達5％。HFMD至今仍無有效的疫苗和特異性治療手段，所以，對EV進行快速檢測無論是對于指導治療還是控制HFMD疫情都具有重要價值。

目前，EV的檢測方法包括病毒分離培養、病毒核酸檢測和血清學檢查三個方面。病毒分離方法費時、費力，檢測種類少，無法滿足疾病流行期間同時處理大量樣本的需要。病毒核酸檢測是采用逆轉錄聚合酶鏈反應(PCR，RT-PCR)技術，為當前腸道病毒快速檢測的主要手段，該方法靈敏度高，但具有樣品污染，假陽性率高等缺點，同時，普通PCR和熒光定量PCR由于各組引物間不兼容性、擴增背景高以及重復性差等因素不利于多重檢測。血清學檢查同樣由于檢測通量局限性而不能滿足檢測需求。傳統固相芯片價格昂貴，敏感性不高，檢測結果可重復性差。液相芯片技術能夠實現高通量檢測，但由于需要PCR擴增存在操作復雜、易污染等缺點。基因芯片技術具有高特異性、高靈敏度、高通量的特點，為臨床和環境檢測提供了良好的應用前景。目前通用的基因芯片技術有多種，但分別都存在著靈敏度不高，或者檢測技術復雜，或者條件和設備要求高的問題限制了該技術在臨床檢測中的應用。當前基于納米金探針技術已被報道應用于肝炎病毒和人乳頭瘤病毒檢測中，該技術通過金標銀染法達到相對定量檢測靶DNA的目的，而其納米探針熒光強度針對不同濃度待測抗原響應值區分差異較小，從而限制了其檢測靈敏度。

發明內容

本發明針對以上現有技術存在的缺點，提出一種快速檢測手足口病病原的納米探針芯片及其制備方法，并通過對其的應用達到檢測種類多、反應時間短、靈敏度高且特異性強的效果。

本發明的原理是：結合納米探針芯片技術，將帶有氨基或者經過氨基修飾的針對病原特征信息的特異性檢測分子，化學偶聯到納米熒光探針，制成納米探針芯片。再將通過能量共振轉移特異淬滅納米熒光探針的信號探針與待測病原分子交聯反應，將信號探針-待測病原復合物與納米探針芯片混合反應后，通過熒光圖譜掃描，根據信號探針對納米探針熒光強度的淬滅程度，以標準品多肽抗原為陽性對照，判定待測物中病原的濃度。從而達到快速準確檢測病原的目的。其中病原特征信息指病原抗原或者病原核苷酸序列。本發明采用了特有的基于能量共振轉移技術的信號放大機制，從而克服了現有納米探針檢測技術的靈敏度局限性。

本發明的發明目的通過以下技術方案實現：

一種檢測手足口病病原的納米探針芯片，主要由分別包被有病原特異性檢測分子的納米熒光探針構成，所述納米熒光探針包括以下納米探針中一種或者幾種：

不同熒光發射波長的水溶性量子點，

硅殼納米熒光探針、

殼聚糖納米熒光探針；

磁性納米熒光探針；

所述特異性檢測分子為以下分子中的至少一種：

EV71抗體或EV71抗原適配子序列；

EV抗體或EV抗原適配子序列；

CAV16抗體或CAV16抗原適配子序列；

針對EV?5’端非編碼區、EV71?VP1區、CAV16?VP1區核酸序列各區段基因中的DNA分子探針。

所述納米熒光探針的熒光發射波長范圍為300-1000nm。

所述EV71抗體的適配子序列為以下5’端經氨基修飾后適配子序列中的至少一種：