[發(fā)明專利]玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌的構(gòu)建

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110056310.1
• 申請日: 2011-03-09
• 公開（公告）號: CN102181460A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊峰山;張一桐;劉春光;劉麗萍;陳思學(xué)
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/113;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務(wù)所 23109
• 代理人: 金永煥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌構(gòu)建。

背景技術(shù)

玉米螟(Ostrinia?furnacalis)俗稱鉆心蟲，是世界性重大害蟲之一，其食性龐雜且分布極廣。我國的華北、東北、西北是玉米螟嚴重危害區(qū)，其主要危害玉米、高粱和棉花等，是玉米的專化性害蟲，主要以幼蟲取食玉米植株和雄穗而造成植株上葉片蟲孔、莖桿折斷導(dǎo)致減產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，玉米螟危害造成玉米減產(chǎn)高達10％～30％。并且，近年來由于氣候變暖、玉米種植密度等因素的改變，玉米螟的危害日益加重。

目前，對玉米螟的防治措施主要包括物理防治、化學(xué)防治和生物防治三大技術(shù)手段。物理防治主要是利用螟蛾的趨光性，用誘蟲燈誘殺玉米螟成蟲以達到殺蟲的效果。但它必須保證夜間連續(xù)供電，且需要大面積統(tǒng)一使用，效果才理想；化學(xué)防治主要是通過噴灑一些化學(xué)顆粒藥劑進行防殺玉米螟，已取得了顯著的效果，是目前防治玉米螟主要的技術(shù)手段。但其最大的缺點就是對生態(tài)環(huán)境造成了很大的污染，這與建立環(huán)保型生態(tài)環(huán)境的觀念是相背的；生物防治同化學(xué)防治相比具有較強的針對性和選擇性，生物防治沒有不良的副作用，可長期有效地控制危害。生物防治中利用白僵菌和赤眼蜂防治需要充分考慮到不同地區(qū)不同的氣候和其它可能影響防治效果的因素。而對于目前應(yīng)用效果較好也較普遍的Bt生物防治手段，其本身也有一定的局限性，它容易被陽光中的紫外線失活，而且害蟲會對它產(chǎn)生抗藥性，從而使它的應(yīng)用受到了限制。因此，尋求新的生物防治方法已成為亟待解決的問題。

昆蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase，GST)是一類在生物代謝中承擔(dān)許多重要生理功能的超基因家族，該酶系在生物體對內(nèi)源性和外源性有毒物質(zhì)(次生代謝物、殺蟲劑等)的降解過程中起著重要作用。其主要功能是催化谷胱甘肽的巰基與一些親電子類有毒物質(zhì)進行軛合反應(yīng)，從而保護一些蛋白質(zhì)免受損傷，達到解毒目的。迄今為止，已在很多昆蟲中克隆到了GST的全長cDNA以及cDNA片段，但尚未有玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，目的是對玉米螟生長發(fā)育起到明顯的抑制作用，從而為農(nóng)業(yè)上防治昆蟲提供一條新的途徑。

本發(fā)明玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA全長為886bp，核苷酸序列如SEQ?IDNo.1所示；該基因所編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶RNAi干擾工程菌的構(gòu)建方法按以下步驟進行：一、用Trizol法提取玉米螟三齡幼蟲中腸總RNA，利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，根據(jù)特定功能的dsRNA片段，設(shè)計特異性上游引物Of-GST-RNAi320-P1和下游引物Of-GST-RNAi320-P2，然后以上述得到的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，獲得目的片段Of-GST-RNAi320；二、目的片段Of-GST-RNAi320與表達載體L4440分別經(jīng)Pst?I和HindIII進行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組質(zhì)粒L4440-Of-GST；三、將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒L4440-Of-GST轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115(DE3)中，即完成玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，命名為htL4440-Of-GST；

其中步驟一中特定功能的dsRNA片段的全長為320bp，核苷酸序列為： CGACGTACTTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTGGAAGAGGCTCTCAAGTTCCTGGACACCTTCCTCGA AGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGACCTGTCGCTCGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCC TACCAGAGTGTCAACAAGTGGTTCACGCTGGTCAAATCTACCGCCCCCAAATACGACGAAGCGAACGGCCAAGGCGTAGAAATGTTTAGAGCCTTCGTGG

本發(fā)明提供玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，對玉米螟生長發(fā)育起到明顯的抑制作用，為農(nóng)業(yè)上防治昆蟲提供一條新的途徑，從而拓展該解毒酶在農(nóng)業(yè)上防治昆蟲方面的應(yīng)用。