[發(fā)明專利]一種融合蛋白及其融合蛋白表達(dá)載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110054917.6
• 申請日: 2011-03-08
• 公開（公告）號: CN102816240A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張克斌;錢桂生;周世文;黃春基;余華;呂勝青;盛哈蕾;何曉梅;熊竣智
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K38/17;A61P31/14;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種融合蛋白及融合蛋白表達(dá)載體，尤其涉及包含人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)與人IgG1的Fc段的融合蛋白。

背景技術(shù)

柯薩奇病毒(Coxsackie?enterovirus)，屬小RNA病毒科(Picornavirus)，為正鏈RNA腸道病毒(Enterovirus)。常引起小兒腹瀉，能導(dǎo)致無菌性腦膜炎、流行性胸痛、心肌炎、心包炎、手足口病等多種疾病，妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰質(zhì)炎性病變，并致胎兒宮內(nèi)感染和致畸。目前發(fā)現(xiàn)，柯薩奇B組病毒(Coxsackie?B?enterovirus，CVB)常引發(fā)小兒病毒性心肌炎(Viral?Myocarditis，VMC)，是小兒及青少年VMC最常見的病原體，約占各種病毒所致心肌炎的50％。腺病毒(adenovirus，Ad)是一類無包膜雙鏈DNA(double-stranded?DNA，dsDNA)病毒，歸屬于哺乳動物腺病毒屬。在自然界中分布較廣，是引起上下呼吸道和眼部疾患的常見病原體；同時可引起人體扁桃體、腺樣體和其它淋巴組織的隱性持續(xù)性感染；此外，腺病毒也是病毒性心肌炎的常見病原體?？滤_奇病、腺病毒的傳染性強，尤其是在人口密集的地方，對免疫力低下的患者(如老年人、骨髓移植患者、白血病、艾滋病患者等)，通過飛沫和接觸傳染，在同一時期可造成區(qū)域性流行或暴發(fā)流行。柯薩奇病毒分為A和B兩類，共30多個血清型；腺病毒可分為A～F?6個亞屬，共51個血清型，目前尚無柯薩奇病毒/腺病毒有效疫苗用于預(yù)防，針對其特異性藥物還有待開發(fā)。

因此，從新的角度研制安全、可靠的防治柯薩奇病毒/腺病毒的新型藥物十分必要。

近年來，一些學(xué)者提出了“病毒受體陷阱療法”(virus?receptor?trap?therapy)這一概念，所謂“病毒受體陷阱療法”是指利用外源性的可溶性病毒受體來結(jié)合病毒，從而阻斷病毒與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合及隨后的病毒內(nèi)吞。由于外源性受體分子與細(xì)胞膜上的受體分子有相同或非常相似的空間結(jié)構(gòu)，因此，多次、大劑量使用將不存在機體的免疫反應(yīng)等問題。病毒受體陷阱療法拓展了病毒性疾病的治療策略，可成為急性病毒血癥期的一個新的有效治療手段。

研究表明，柯薩奇病毒和腺病毒通過與細(xì)胞表面的柯薩奇病毒/腺病毒受體(Coxsackie?virus?and?adenovirus?receptor，CAR)特異性地結(jié)合完成感染最初的吸附過程，隨后通過五鄰體蛋白上的精-甘-天門冬氨酸(RGD)序列與細(xì)胞表面的整合素αγβ3和αγβ5結(jié)合經(jīng)過胞飲作用使病毒進(jìn)入細(xì)胞從而完成內(nèi)化過程。因此，CAR是絕大部分柯薩奇病毒和腺病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵。

目前，CAR的基礎(chǔ)性研究已非常深入。研究表明，CAR是分子量為46KD的跨膜糖蛋白，編碼人源CAR(hCAR)的基因已明確定位于染色體21q?11.2上，包含7個外顯子，365個氨基酸，分3個結(jié)構(gòu)域。①胞外域：含兩個Ig結(jié)構(gòu)域(1.2)，Ad通過纖維頂球的三聚體結(jié)構(gòu)與Ig1結(jié)構(gòu)域結(jié)合。②跨膜段：含22個氨基酸，對細(xì)胞間相互作用起穩(wěn)定調(diào)節(jié)作用。③胞內(nèi)域：含107個氨基酸，其中前兩位Cys殘基可能是翻譯后脂化修飾位點，此外，胞內(nèi)域可能還存在Tyr磷酸化位點。

基于這些已有的基礎(chǔ)性研究，如果通過基因工程方法，獲得CAR的胞外區(qū)蛋白(extracellular?region?of?CAR，exCAR)，用于Ad的“受體陷阱療法”，將能有效的阻止絕大部分型別的腺病毒對人體細(xì)胞的感染。

目前，在“病毒性疾病的受體陷阱療法”這一領(lǐng)域已有一些探索性研究，但僅停留在體外細(xì)胞實驗和動物模型研究的初步階段。究其原因，最主要的是活性蛋白的高效表達(dá)問題。目前的相關(guān)研究一是采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能獲得較高產(chǎn)量的表達(dá)蛋白，但其蛋白表達(dá)形式多為包涵體，難以獲得大量可溶性活性蛋白；二是采用細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)，如CHO細(xì)胞和293T細(xì)胞等，此類表達(dá)系統(tǒng)能解決表達(dá)蛋白的正確折疊和糖基化問題，但其產(chǎn)量很低，成本極高，大量制備極為困難。

所以，“病毒受體陷阱療法”將來應(yīng)用人體治療，實現(xiàn)的關(guān)鍵是能生產(chǎn)制備大量可純化的具有高生物活性的病毒受體或其亞單位。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白及融合蛋白的表達(dá)載體。

本發(fā)明所述的融合蛋白，包含人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)與人IgG1的Fc段。

所述人源性柯薩奇病毒-腺病毒受體胞外區(qū)的基因序列其序列如SEQ?IDNO：1所示。

所述人IgG1的Fc段的基因序列其序列如SEQ?ID?NO：2所示。