[發明專利]黃瓜細菌性角斑病菌檢測用引物

無效

• 申請號: 201110053822.2
• 申請日: 2011-03-07
• 公開（公告）號: CN102181522A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 趙文軍;王哲;李志紅;朱水芳;陳洪俊
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院;中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京億騰知識產權代理事務所 11309
• 代理人: 陳惠蓮

技術領域

本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及黃瓜細菌性角斑病菌檢測用引物。

背景技術

黃瓜細菌性角斑病菌(Pseudomonas?syringae?pv.lachrymans)是世界性黃瓜病害，主要侵染黃瓜，該病菌在種子內、外或隨病殘體在土壤中越冬，遠距離傳播主要依靠帶菌種子。該病目前在世界各地均有分布，在我國主要分布在華北、東北及華中地區。近年來我國黃瓜種植面積不斷增大，黃瓜育種產業發展很快，黃瓜種子遠距離調運的頻次及數量也大幅度增加，因此該病傳播及擴散的風險日益增大。

本研究選擇黃瓜細菌性角斑病菌gap1基因設計一對引物，建立了黃瓜細菌性角斑病菌的PCR檢測方法，反應結束后利用凝膠電泳檢測判定是否有黃瓜細菌性角斑病菌。

發明內容

本發明目的在于提供用于黃瓜細菌性角斑病菌PCR檢測用引物序列。

本發明通過分析黃瓜細菌性角斑病菌gap1基因序列的基礎上，設計了引物。所述的引物對由正向和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表PSL-F和PSL-R所示。

本發明還進一步給出了應用上述引物進行PCR檢測的方法，其以樣品菌液或者植物提取DNA為模板，進行PCR擴增，反應結束后根據電泳檢測擴增片段判定結果。

具體地說本發明以樣品菌液或者植物提取DNA為模板，進行PCR反應，即在25μL反應體系中加入18.3μL超純水，10×PCR?buffer2.5μL，1μL引物PSL-F(20μmol/L)，1μL引物PSL-R(20μmol/L)，(10mmol/L)dNTP?1μL，模板1μL，空白對照加1μL超純水代替模板，Taq?DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL。其中，上述反應條件可以是：94℃5min；94℃30S，58℃30S，72℃30S，35個循環；72℃8min。

進一步，還可以將本發明引物及相關試劑組裝成試劑盒，以方便使用。

本發明根據黃瓜細菌性角斑病菌gap1基因序列設計引物，該引物特異性好，用于PCR檢測靈敏性高。本發明檢測方法準確性高、靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有黃瓜細菌性角斑病菌，為黃瓜種子進出口安全提供了保證。

附圖說明

圖1：本發明檢測方法對黃瓜細菌性角斑病菌檢測的實驗結果

所有參試的12株黃瓜細菌性角斑病菌均能擴增出單一的179bp的電泳條帶。圖1中M：Marker?DL2000；1-10分別為來源于NCPPB菌種保藏中心的黃瓜細菌性角斑病菌，NCPPB編號分別為540，541，542，543，277，467，1425，1428，1096，1097；條帶11及12為2株吉林分離物；13為空白對照。

圖2是本發明檢測方法的靈敏度實驗結果。

圖2中M：Marker?DL2000，1-7分別為：7.5×10⁷、7.5×10⁶、7.5×10⁵、7.5×10⁴、7.5×10³、7.5×10²、7.5×10¹、7.5×10⁰cfu/mL，8：空白對照，結果顯示7.5×10³cfu/mL以上濃度菌液均可觀察到電泳條，空白對照無條帶。經過換算，本檢測方法最低檢測限大約是7.5個細菌。

圖3是本發明檢測方法對黃瓜葉片的檢測應用實驗。

圖3中M為Marker?DL2000；1-3為NCPPB?540菌株及2個吉林分離菌株接種黃瓜葉片后提取DNA擴增條帶；4為健康黃瓜植株葉片提取的DNA；5為空白對照。

具體實施方式

下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1引物的設計與合成

根據黃瓜細菌性角斑病菌gap1基因序列，利用Primer?Premier

5.0軟件設計引物，引物序列為：

PSL-F(正向)：5′-GTTCGGCGACGCAATCAATG-3′

PSL-R(反向)：5′-GTTGACTTCTTCGGCGGTGG-3′

實施例2PCR擴增方法的建立

1、PCR反應體系