[發(fā)明專利]用于鑒定雞早期胚胎性別的PCR擴(kuò)增引物和方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110053140.1
• 申請(qǐng)日: 2011-03-04
• 公開（公告）號(hào): CN102181521A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周振明;孟慶翔;任麗萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及禽類早期胚胎性別鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于鑒定雞早期胚胎性別的PCR擴(kuò)增引物和方法。

背景技術(shù)

雞胚胎是發(fā)育生物學(xué)研究的理想模型。雞的卵子從卵巢上排出后被輸卵管漏斗部接納，此后與精子相遇受精。雞卵受精后，在輸卵管內(nèi)向下移動(dòng)過程中受精卵經(jīng)過分裂，形成中央透明、周圍暗的胚盤。母雞在產(chǎn)蛋時(shí)，受精卵已發(fā)育到了胚胎的囊胚階段，含有4～6萬個(gè)未分化的細(xì)胞，胚盤直徑為4～5mm，厚度約250μm。胚盤細(xì)胞可以在體外進(jìn)行操作、遺傳修飾和選擇，將外源基因轉(zhuǎn)染胚盤細(xì)胞，通過胚盤注射制備嵌合體可獲得含有外源基因的子代。但是，在制備嵌合體的模型時(shí)存在供受體的性別問題，目前無論胚盤細(xì)胞嵌合體還是原始生殖細(xì)胞嵌合體所轉(zhuǎn)移的細(xì)胞都是未知性別或混合性別，這就不可避免的導(dǎo)致供受體性別的不一致性，出現(xiàn)異性移植制備嵌合體。因此，為了能夠有目的制備同性嵌合體，研究性別性腺發(fā)育的生物學(xué)機(jī)制或者雞胚性腺基因的表達(dá)，需要在更早階段鑒定雞胚胎的性別。

自從在禽類雌性特異的W染色體上發(fā)現(xiàn)一類重復(fù)的核酸限制性內(nèi)切酶Xho?I和EcoR?I的位點(diǎn)序列后，通過分子生物學(xué)方法鑒定雞胚胎性別的取得了顯著進(jìn)步。EcoR?I家族與Xho?I家族的重復(fù)序列占整個(gè)W染色體總DNA的70％～90％，這些大重復(fù)片段又由許多串聯(lián)的結(jié)構(gòu)相似的21bp亞單位構(gòu)成。這些重復(fù)序列構(gòu)成了W染色體的異染色質(zhì)區(qū)域，是鑒定W染色體的基礎(chǔ)。Clinton等人(2001)建立了一種雞胚胎性別的鑒定的方法。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增W染色體上的一段415bp的Xho?I位點(diǎn)重復(fù)序列和18S核糖體基因中第?1267～1522nt之間的256bp片段；對(duì)照反應(yīng)與特異反應(yīng)在同一管內(nèi)一次完成。但是，該方法仍然需要通過提取基因組DNA，其步驟相對(duì)繁瑣、費(fèi)時(shí)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供用于鑒定雞早期胚胎性別的PCR擴(kuò)增引物和方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于鑒定雞早期胚胎性別的PCR擴(kuò)增引物，包括引物P1～P4(見核苷酸序列表SEQ?ID?NO.1～4)，具體為：

P1：5′-cat?gcc?ttt?cta?ccg?caa?ata?c-3′(SEQ?ID?NO.1)，

P2：5′-tta?agg?tgc?ttt?ttt?tct?ggg-3′(SEQ?ID?NO.2)；

P3：5′-tgc?agc?tct?ttc?tcg?att?ccg?tg-3′(SEQ?ID?NO.3)，

P4：5′-atg?ggg?tag?aca?caa?gct?gag?cc-3′(SEQ?ID?NO.4)；

其中，上游引物P1和下游引物P2用于擴(kuò)增母雞W染色體上高度重復(fù)序列EcoR?I家族的447bp片段；上游引物P3和下游引物P4用于擴(kuò)增公雞和母雞共同存在的18S核糖體基因中第1267～1522nt之間256bp片段。

本發(fā)明還提供一種鑒定雞早期胚胎性別的方法，以雞胚盤細(xì)胞為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)帶型判斷性別，雌性為兩條帶，雄性為一條帶。

進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

每25μl的反應(yīng)體系中含有：

所述的PCR反應(yīng)條件為：

35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

進(jìn)一步地，所述雞胚盤細(xì)胞抽取自未孵化受精雞蛋的胚胎明區(qū)。

進(jìn)一步地，所述抽取雞胚盤細(xì)胞的工具為直徑50μm、30°斜角的玻璃針。

其中，玻璃針的制備方法如下：設(shè)定拉針儀(Narishige?PN30，日本)參數(shù)，裝上薄壁毛細(xì)玻璃管(1.0×100mm)，用固定旋鈕固定好，按下拉針儀開關(guān)，將其拉制成玻璃針；取下玻璃針裝在煅針儀(Narishige?MF-900，日本)的持針架上，將注射針移至玻璃球側(cè)面，使其內(nèi)徑50μm處靠近玻璃球，點(diǎn)壓加熱開關(guān)，將其裁斷。用磨針器(Narishige?EG-400，日本)將尖端磨成30°斜角；在無水乙醇中清洗5次。置于超凈臺(tái)中晾干，待用。

本發(fā)明還提供了含有所述引物的雞早期胚胎性別鑒定試劑盒，所述試劑盒還可包括Taq?DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液及其它本領(lǐng)域公知的用于PCR擴(kuò)增的組分。

本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：