[發(fā)明專利]一種測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110052578.8
• 申請日: 2011-03-07
• 公開（公告）號: CN102174641A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱泓;林先貴;王一明
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南京土壤研究所
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N27/447
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物蛋白酶檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法。

背景技術(shù)

酶譜法（zymography）是一種在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)的基礎(chǔ)上通過特異性底物和丙烯酰胺共聚合來測定酶活性的電泳檢測技術(shù)。明膠酶譜法是測定蛋白酶活性的一種常用手段，因該技術(shù)能測定多種降解明膠的蛋白酶活性，且具有方法簡單、檢測結(jié)果直觀和定量等優(yōu)點，近年來被廣泛應(yīng)用于生物蛋白酶檢測技術(shù)領(lǐng)域。

然而，大量的檢測數(shù)據(jù)顯示該方法仍存在一些缺點。如：1、缺乏一種能夠適用于多數(shù)蛋白酶的通用方法。2、缺乏特異性更高且能和丙烯酰胺偶聯(lián)的底物。3、難以測定一些SDS敏感蛋白酶的活性。4、難以測定一些含堿性蛋白酶的組分的活性。

相關(guān)文獻:

相關(guān)的美國專利包括：7，153，660?B2，?US2003/0171271?A1。相關(guān)日本專利包括：JP20010023781，?JP20010131，?JP20040299951，?JP20041014。相關(guān)文獻包括：?Choi?NS?et?al.，?2006，?J.?Microbiol.?Biotechnol.?16:457-464;?Boonyaras?Kim?SH?and?Choi?NS，?2000，?Biosci.，?Biotechnol.，?Biochem.?64:1722-1725;?Cristiane?M.C.?de?Salles?et?al.，?2006，?Anal.?Biochem.?357:153-155;?Christa?Heussen?and?Eugene?B.?Dowdle，?1980，?Anal.?Biochem.?102:196-202;?Eiichi?Saitoh?et?al.，?2007，?Anal.?Chem.?Insights?2:51-59;?Choi?NS?and?Kim?SH，?2000，?Anal.?Biochem.?281(2):236-8;?Choi?NS?et?al.，?2005，?J.?Microbiol.?Biotechnol.?15:35-39;?Jeff?Wilkesman?and?Liliana?Kurz，?2009，?Recent?Pat.?Biotechnol.?3:175-184;?Choi?NS?et?al.，?2009，?Anal.?Biochem.?386:121-122;?Choi?NS?et?al.，?2001，?J.?Biochem.?Mol.?Biol.?34:531-536;Choi?NS?et?al.，?2003，?J.?Biochem.?Mol.?Biol.?37:298-303;?PA?Snoek-van?Beurden?and?JW?Von?den?Hoff，?2005，?BIOTECHNIQUES??38:73-83;?Choi?NS?et?al.，?2005，?J.?Microbiol.?Biotechnol.?15:537-543;?R.?Porcel?et?al.，?2001，?J.?Colloid?Interface?Sci.?239:568-576;?A?Granelli-Piperno?and?E?Reich，?1978，?J.?Exp.?Med.;?TM?Leber?and?FR?Balkwill，?1997，?249:24-28;?騫愛榮等，?2003，?解放軍醫(yī)學(xué)雜志，?28：282-283;?姜微波等，?2002，?植物學(xué)通報，?19:607-610。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的在于解決酶譜測定時堿性蛋白酶活性難以檢測的問題，對現(xiàn)有基于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）基礎(chǔ)上的酶譜方法進行了改進，提供了一種檢測堿性蛋白酶活性的方法。該方法的效果要明顯好于用增加電泳時間來檢測堿性蛋白酶的酶譜改進方法。

技術(shù)方案：本發(fā)明的技術(shù)方案為一種測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配制步驟和電泳步驟，電泳用聚丙烯酰胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯酰胺凝膠組成：

a.?聚丙烯酰胺凝膠I由7質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液I和1質(zhì)量份濃縮膠緩沖液組成，其中：

（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、過硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為6.67%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）質(zhì)量體積比0.133%。