[發明專利]葡糖淀粉酶變體

無效

• 申請號: 201110052276.0
• 申請日: 2006-11-17
• 公開（公告）號: CN102174489A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 杰普.W.塔姆斯;斯蒂芬.丹尼爾森;埃斯本.P.弗里斯
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12P19/14;C12P7/06;C12G3/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 史悅

本申請是申請日為2006年11月17日、申請號為200680042983.9(國際申請號為PCT/DK2006/000638)、發明名稱為“葡糖淀粉酶變體”的發明申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及具有改進性質的葡糖淀粉酶變體和使用所述葡糖淀粉酶變體的方法。

背景

葡糖淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶(1，4-alpha-D-glucan?glucohydrolase)，EC?3.2.1.3)是催化D-葡萄糖從淀粉或相關的寡糖和多糖分子的非還原端釋放的酶。葡糖淀粉酶由幾種絲狀真菌和酵母產生。

商業上，使用葡糖淀粉酶將已經用α-淀粉酶部分水解的玉米淀粉轉化為葡萄糖。在高果糖玉米糖漿(HFCS)生產中，通過葡萄糖異構酶進一步將葡萄糖轉化為由幾乎相等的葡萄糖和果糖組成的混合物。這種混合物是普遍使用的高果糖玉米糖漿，其商業化遍布全球。對于高果糖玉米糖漿使用最多的是源自埃默森踝節菌(Talaromyces?emersonii)和黑曲霉(Aspergillus?niger)的葡糖淀粉酶。

在商業上用于高果糖玉米糖漿生產的高固體濃度下，葡糖淀粉酶由通過縮合產生的葡萄糖合成二糖、三糖和四糖。這種情況的發生是由于淀粉中α-(1-6)-D-糖苷鍵的緩慢水解和由D-葡萄糖形成多種積累的縮合產物，主要是異麥芽糖。因此，轉化方法中的葡萄糖產率不超過理論產率的95％。全世界通過這種方法產生的HFCS量非常大，而在每噸淀粉的葡萄糖產率上即使非常小的增加在商業上也是重要的。

本發明的目的是減少特定葡糖淀粉酶的縮合產物的形成，所述葡糖淀粉酶可以從真菌生物，特別是踝節菌屬(Talaromyces?genus)和曲霉屬(Aspergillus?genus)的菌株獲得，并且已經基于它們的合適性質，例如淀粉轉化中的性質，對所述葡糖淀粉酶本身進行了選擇。

發明簡述

申請人們目前發現通過在親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的特殊區域中的特殊位置引入一些變化，來降低形成α-(1-6)鍵的速率，和/或減少異麥芽糖的形成。葡糖淀粉酶切割并因而形成α-(1-6)鍵的速率相對于其切割α-(1-4)鍵的速率的降低具有實際意義。葡糖淀粉酶能夠在副產品量顯著減少的情況下產生葡萄糖，這將有重要的商業意義，例如，從淀粉生產甜味劑時。

本發明的發明人提供了親本葡糖淀粉酶的許多變體，所述變體顯示減少的縮合。通過在糖化方法中使用本發明的葡糖淀粉酶變體，能夠產生具有非常高葡萄糖百分比的糖漿。通過突變，例如通過在親本葡糖淀粉酶中取代和/或缺失和/或插入選擇的位置來獲得減少的縮合。這將在下文中詳細描述。

因此，在第一個方面，本發明涉及親本葡糖淀粉酶的變體，當與親本葡糖淀粉酶比較時，所述變體葡糖淀粉酶的縮合產物產量減少。

因此，在第二個方面，本發明涉及親本葡糖淀粉酶的變體，其在以下區域之一中包含變化：區域248-255，例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255的一個或多個中，區域309-318，例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318的一個或多個中，和/或區域409-415，例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415的一個或多個中，其中(a)所述變化獨立地是(i)在占據該位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)缺失占據該位置的氨基酸，或(iii)用不同的氨基酸取代占據該位置的氨基酸，(b)所述變體具有葡糖淀粉酶活性，并且(c)各位置相應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的區域或位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQ?ID?NO：1的氨基酸序列，和/或相應于同源葡糖淀粉酶中的區域或位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQ?ID?NO：1中所示氨基酸序列具有至少50％同一性程度。

在第三個方面，本發明涉及DNA構建體，其包含編碼根據第一個方面的葡糖淀粉酶變體的DNA序列。

在第四個方面，本發明涉及重組表達載體，其攜帶根據第二個方面的DNA構建體。

在第五個方面，本發明涉及細胞，將所述細胞用根據第二個方面的DNA構建體或根據第三個方面的載體轉化。

在第六個方面，本發明涉及根據第四個方面的細胞，所述細胞是微生物，尤其是細菌或真菌。

在第七個方面，本發明涉及用于將淀粉或部分水解的淀粉轉化為含有葡萄糖(dextrose)的糖漿的方法，所述方法包括在根據第一個方面的葡糖淀粉酶變體存在下糖化淀粉水解物。