[發(fā)明專利]一種對(duì)轉(zhuǎn)入玉米的Bar基因進(jìn)行篩選的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110051769.2
• 申請(qǐng)日: 2011-03-04
• 公開（公告）號(hào): CN102181475A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 季靜;王罡;汪婷婷;關(guān)春峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12Q1/68;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物基因工程中的對(duì)轉(zhuǎn)基因愈傷組織進(jìn)行篩選的方法，特別是對(duì)轉(zhuǎn)入玉米的Bar基因愈傷組織進(jìn)行篩選的方法。

背景技術(shù)

篩選含有目的基因的轉(zhuǎn)化體是基因工程的重要環(huán)節(jié)。其基本方法是將篩選標(biāo)記基因和目的基因構(gòu)建到同一載體上，通過(guò)對(duì)未轉(zhuǎn)化體的選擇性抑制，達(dá)到篩選轉(zhuǎn)化體的目的，選擇標(biāo)記基因主要是抗生素或抗除草劑基因。以往基因轉(zhuǎn)化中一般采用抗生素作為篩選標(biāo)記系統(tǒng)。由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)抗生素的解毒作用導(dǎo)致的交叉保護(hù)，高頻率的未轉(zhuǎn)化植株和嵌合體也通過(guò)了抗生素篩選。目前，抗除草劑基因已越來(lái)越多地應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，它克服了抗生素篩選的局限性，細(xì)胞產(chǎn)生的假轉(zhuǎn)化體很少，已成功地用于小麥、水稻、玉米、大麥、高粱、燕麥、黑麥、油菜等作物的轉(zhuǎn)化。

抗廣譜除草劑草丁膦(glufosinate)的Bar基因(bialaphos?resistance?gene)是常用的選擇標(biāo)記基因之一，已被克隆與測(cè)序，通過(guò)生物技術(shù)已將該基因?qū)?0多種作物。

在培養(yǎng)基中用草丁膦篩選轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織的Bar基因較為困難。草丁膦屬有機(jī)磷類除草劑，是非選擇性、廣譜除草劑Liberty(商業(yè)用名還有Basta、Ignite、Challange及Finale等)的活性成份。在一些文獻(xiàn)中常被稱為Phosphinothricin(PPT，膦絲菌)。L-草丁膦強(qiáng)烈抑制細(xì)菌和植物的氨基酸生物合成酶-谷氨酰胺合成酶(Glutam?ine?synthetase?GS)。雙丙氨膦(bialaphos)是由鏈霉素屬(S?treptomyces)的一些小種產(chǎn)生的草丁膦的三肽前體，它由來(lái)自于這些小種中的2個(gè)L-丙氨酸殘基并與PPT相連組成。完整的三肽不具離體抑制活性。通過(guò)植物體中的肽酶除去2個(gè)L-丙氨酸殘基后，在細(xì)胞內(nèi)釋放出的PPT才有活性。但在植物組織培養(yǎng)中，植物細(xì)胞缺乏光照和光和作用，草丁膦在無(wú)法起到篩選的作用，發(fā)現(xiàn)用草甘膦篩選Bar基因效果較好。

Bar基因的抗性機(jī)理：(1)產(chǎn)生過(guò)量的靶標(biāo)酶或靶標(biāo)蛋白質(zhì)，降低除草劑毒性。有多種形式的GS同工酶，只有細(xì)胞質(zhì)形式GS和PPT抗性有關(guān)。(2)產(chǎn)生能修飾除草劑的酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前將其降解或解毒。Glufosinate(或bialaphos)抗性Bar基因，克隆來(lái)自土壤吸水鏈霉菌(S?treptomyces?hygroscopicus)。它編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinthricin?acetyltransferase?PAT)，PAT使PPT的自由氨基乙酰化從而對(duì)PPT解毒，使之不能抑制GS的活性。含有該基因的植物具有對(duì)Liberty的抗性。

草甘膦作為一種非選擇性除草劑，其作用機(jī)理主要是競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。該合成酶是真菌、細(xì)菌、藻類和高等植物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵性的酶。目前，關(guān)于用草甘膦篩選Bar基因的方法尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)轉(zhuǎn)入玉米的Bar基因進(jìn)行篩選的方法，可以減少假陽(yáng)性植株的產(chǎn)生，大大提高了篩選效率，避免了大量的重復(fù)勞動(dòng)，對(duì)于玉米基因工程和遺傳育種實(shí)踐具有重要意義。

本發(fā)明提供的一種對(duì)轉(zhuǎn)入玉米的Bar基因進(jìn)行篩選的方法包括以下步驟：

經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體接種于攜帶雙元質(zhì)粒p3300的農(nóng)桿菌菌株EHA105的菌液中浸染，浸染后的外植體經(jīng)共培養(yǎng)、含有草甘膦的篩選培養(yǎng)基I與篩選培養(yǎng)基II中篩選，再依次經(jīng)過(guò)再生培養(yǎng)基I與再生培養(yǎng)基II中再生培養(yǎng)誘導(dǎo)形成胚狀體和苗體，選擇苗體盆栽得到的抗性植株，再用PCR檢測(cè)和經(jīng)凝膠電泳法證實(shí)篩選獲得陽(yáng)性植株為轉(zhuǎn)基因植株。

所述的雙元質(zhì)粒p3300是在其上的T-DNA區(qū)含有八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)和PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Bar)。

所述的農(nóng)桿菌菌液是將攜帶雙元質(zhì)粒p3300的農(nóng)桿菌菌株EHA105的單菌落接種于含100mg/l卡那霉素的YEP培養(yǎng)液中，28℃、160rpm振蕩培養(yǎng)12h，當(dāng)細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，4℃、4000rpm離心收集菌體，重懸于感染培養(yǎng)基，菌液濃度約為OD₆₀₀＝0.6-0.8.

所述的外植體的預(yù)培養(yǎng)是取自交系的8-13d的幼雌穗，表面用75％的酒精消毒，再用0.1％的氯化汞浸泡8分鐘，無(wú)菌水洗3次后挑取幼胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，24℃條件下暗培養(yǎng)7～10d后，拔去生長(zhǎng)出的微芽，轉(zhuǎn)入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，繼代2～3周產(chǎn)生I型愈傷組織，繼代1～2次后產(chǎn)生II型愈傷組織，每14d繼代1次；取生長(zhǎng)旺盛的II型愈傷組織作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料。