[發明專利]一種通過帶病組培誘導獲得抗棗瘋病突變株的方法

無效

• 申請號: 201110051577.1
• 申請日: 2011-03-04
• 公開（公告）號: CN102100179A
• 公開（公告）日: 2011-06-22
• 發明（設計）人: 劉孟軍;劉曉光;趙錦;代麗
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種通過持續帶病組培誘導獲得抗棗瘋病突變株的方法。

背景技術

棗瘋病(Jujube?witches’broom?disease)由植原體(phytoplasma)引起，是棗樹生產上發生最普遍、危害最嚴重的致死性傳染性病害。棗樹感染棗瘋病后，葉片變小、花器和托葉刺退化成小葉、枝葉叢生，輕者3-5年、重者1-2年后死亡。棗瘋病為維管束系統病害，防治非常困難，選育優良抗病品種是解決棗瘋病問題的根本途徑。目前，利用傳統地方品種中存在的自然變異進行株系選優，仍是棗樹最主要的新品種選育方法。河北農業大學中國棗研究中心，經過8年時間，通過株系選優選育出了國內外第一個高抗棗瘋病棗樹新品種‘星光’。但株系選優存在著被動等待變異、可遇不可求、難于定向培育品種的問題。

本專利發明人在對感染棗瘋病的婆棗進行組織培養的過程中，發現在大量的病苗群體中有看似健康的個體(疑似抗病突變株)。其基本特征是：葉片明顯變大，莖增粗，節間伸長，無托葉刺變成小葉的狀況，托葉刺不可見或變正常，腋芽不萌發或正長萌發。據此分析，如果能建立一套利用帶病組培苗中強大的病原選擇壓、通過對帶病組培苗的持續培養誘發抗病突變株的方法，將會大大推動抗棗瘋病育種的進程，有利于棗產業的持續健康發展。

通過文獻查閱，通過帶病(棗瘋病)組培苗的持續培養誘發抗棗瘋病突變株的方法，尚未見報道。

發明內容

本發明建立了一套通過帶病(棗瘋病)組培苗的持續培養誘導抗棗瘋病突變株的方法，為抗棗瘋病品種選育開辟了新途徑。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：以帶棗瘋病組培苗為材料，通過持續繼代培養，誘發抗棗瘋病突變株，通過形態變異篩選、分子水平遺傳變異鑒定和棗瘋病抗性鑒定等，篩選出對棗瘋病抗性顯著提高的突變株。

本發明的具體內容，即組培條件下誘發抗棗瘋病突變株的具體方法如下：

(1)帶棗瘋病組培苗材料的準備。采集感染棗瘋病的嫩芽為外植體，在不加入任何植物生長調節劑的MS培養基中(蔗糖濃度為30g/L，培養基滅菌前pH值6.0)進行啟動培養和繼代培養(培養室溫度為28±2℃)，獲得大群體的帶病組培苗。

(2)疑似突變株的初步篩選。在上述獲得的帶病組培苗中，觀察篩選在外觀形態上看似健康的個別的疑似突變株，確定疑似突變株的基本標準是：與正常的帶病組培苗相比，葉片明顯變大，莖增粗，節間伸長，托葉刺不可見或變正常，腋芽不萌發或正長萌發。

(3)疑似突變株的復選。將按上述標準確定的疑似突變單獨挑選出來，轉入新的不添加任何植物生長調節劑的MS培養基中單獨繼代培養，這些疑似突變株在培養過程中還會出現形態上的分化，有的繼續保持健康狀態，有的變回瘋苗狀態；將外觀形態仍表現健康的組培?苗再次挑選出來，繼續單獨培養；如此反復，直到疑似突變株在繼代培養后不再出現形態分化，全部表現為健康植株為止，作為復選突變株。

(4)突變株的決選和確定。對上述篩選出的復選突變株進行AFLP(擴增片段長度多態性，Amplificd?fragment?length?polymorphism)檢測，以一直表現典型棗瘋病癥狀、未發生疑似突變的同一品種的組培苗為對照，鑒定出具有特征性DNA差異條帶的復選突變株，作為決選突變株；進而以其為接穗，在組培條件下嫁接到表現典型棗瘋病癥狀的組培苗砧木上，進行棗瘋病抗性鑒定，接穗芽萌發45天后仍不表現棗瘋病癥狀的，確定為抗棗瘋病突變株。

本發明專利的有益效果是，建立了一套較完善的利用帶病組培苗中強大的病原選擇壓、通過對帶病組培苗的持續培養誘發抗棗瘋病突變株的方法。利用該技術，可實現在組織培養條件下規模化快速獲得抗棗瘋病新種質，其應用將會大大推動抗棗瘋病育種的進程，有利于棗產業的持續健康發展。

附圖說明

圖1是篩選疑似突變株的形態標準。

圖2是大群體、次群體和變異株,?突變株、次群體和瘋苗群體(從左至右)。

圖3是嫁接接種鑒定突變株的抗病性。

具體實施方式

以感病品種婆棗感染棗瘋病的嫩芽為外植體，在不加任何植物生長調節劑的MS培養基(基滅菌前pH值6.0，蔗糖濃度為30g/L)中進行啟動培養和繼代培養(培養室溫度為28±2℃)，獲得組培苗；以葉片明顯變大、莖增粗、節間伸長、托葉刺不可見或變正常、腋芽不萌發或正長萌發為標準，從中挑選出在形態上看似健康的疑似突變株系個；將疑似突變株系單獨在不添加任何植物生長調節劑的MS培養基中繼代培養，從中剔除恢復病癥的組培苗而將外觀形態仍表現健康的組培苗再次挑選出來，進一步單獨繼代培養；如此反復7次，篩選出繼代培養后不再出現形態分化、全部表現健康的疑似突變株系7個；對這些疑似突變株進行AFLP檢測，以未發生疑似突變一直表現典型的棗瘋病癥狀的婆棗組培苗為對照，鑒定出具有特征性差異條帶的突變株系3個，進而以其為接穗，在組培條件下嫁接到表現典型棗瘋病癥狀的婆棗組培苗砧木上進行棗瘋病抗性的嫁接接種鑒定，最后鑒定篩選出在接穗芽萌發45天后仍沒有表現出棗瘋病癥狀的抗棗瘋病突變株系3個。