[發明專利]一種小鼠白內障模型及其構建方法

無效

• 申請號: 201110051569.7
• 申請日: 2011-03-03
• 公開（公告）號: CN102450230A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 鮑世民;李凱;趙國際;陳燁;孫宗國
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院;東華大學
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02;C12Q1/68
• 代理公司: 上海東創專利代理事務所(普通合伙) 31245
• 代理人: 馬云;曹立維

技術領域

本發明屬生物技術和醫學領域，具體涉及小鼠白內障自發突變基因純系BALB/cAnSlac-Crygc-del的構建及其應用。

背景技術

小鼠已成為研究人類疾病的一種重要模式生物，哺乳動物發育相關的功能基因的鑒定多來源于自發或誘發突變的小鼠。小鼠先天性白內障(congenital?cataract)為出生時或出生后第一年內發生的晶狀體混濁，小鼠白內障表型多由單基因突變引起，且具有高度的遺傳異質性，與晶狀體發育和分化有關的基因突變可形成遺傳性白內障。

2006年在，在BALB/cAnSlac近交系小鼠與ICR遠交系的雜交F1代群體中，發現2只自發突變導致白內障的小鼠(上述兩品系雜交自發突變導致白內障小鼠的幾率為千分之0.625)。經與BALB/cAnSlac進一步回交10代，繁育攜帶白內障癥狀的純系小鼠，保持了穩定的顯性常染色體遺傳特征，但未知其具體突變基因及位置。

目前對單基因遺傳致病基因的克隆多采用位置克隆的策略。通過覆蓋高密度的遺傳位標(marker)在家系中進行基因組掃描，基因組掃描的關鍵是計算所需遺傳位標的個數。一般認為72只F2代患病白內障小鼠僅需要46個STR(short?tandem?repeat)位點用于基因定位。對于顯性遺傳性白內障小鼠，若某位點純合基因型占患病樣本的比率低于25％，即為連鎖，通過連鎖分析的方法，先找到與致病基因緊密連鎖的標記，從而將致病基因初步定位于染色體某一適當狹窄的區域，然后在該區域內使用覆蓋程度更高的標記物作深入的連鎖分析，就可將致病基因確定在較小的區域。cDNA測序技術結合基因分型技術進一步驗證了白內障基因的突變位點和方式，由此構建的小鼠白內障自發突變基因純系，給予了我們從遺傳學角度研究個體疾病發生機制的良好平臺。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種攜帶白內障癥狀的純系小鼠BALB/c+/+的模型及其構建方法，本發明的白內障癥狀純系小鼠BALB/c+/+可以研究在與C3H/He連續回交2代基礎上，挑選白內障癥狀小鼠用于遺傳學鑒定白內障基因，得到了穩定遺傳的小鼠白內障自發突變基因純系BALB/cAnSlac-Crygc-del，是用遺傳學方法研究自發性白內障致病機制的有力工具。

本發明的小鼠白內障模型構建方法，包括：

(1)回交

(a)取BALB/cAnSlac小鼠與SLAC:ICR小鼠雜交，獲得子代，篩選出白內障小鼠；

(b)以白內障小鼠為父本，以BALB/cAnSlac品系為母本雜交得到F1代；F1代挑選白內障癥狀小鼠與BALB/cAnSlac回交至少10代，培育成攜帶白內障癥狀的純系小鼠BALB/c+/+；

(c)BALB/c+/+小鼠與遺傳背景已知的C3H/He連續回交2代，獲得F2代，挑選白內障癥狀小鼠用于遺傳學鑒定。

(2)遺傳學鑒定

(a)從NCBI(National?Center?for?Biotechnology?Information)選取平均覆蓋19條常染色體的共44個STR位點，STR位點在C3H/HeJSlac和BALB/cAnSlac兩個品系中的片斷長度互不相同，并相差4個bp以上，對這些位點進行引物設計，鑒定回交小鼠的基因組DNA。

(b)從NCBI(National?Center?for?Biotechnology?Information)上進一步選取精細定位所用遺傳位標，STR位點在C3H/HeJSlac和BALB/cAnSlac兩個品系中的片斷長度互不相同，并相差4個bp以上，然后對這些STR位點進行引物設計，通過全基因組掃描與單倍型分析，將白內障相關基因精細定位到小的區段內；

(c)挑選區段內晶狀體蛋白基因Cryg作為候選基因，針對其cDNA序列設計合適的引物，以野生型、白內障雜合型、純合型為模板，進行PCR擴增，將PCR產物測序；

(d)對Cryg突變位點設計一對熒光引物，以野生型、白內障雜合型、純合型為模板，進行擴增，驗證Cryg突變位點，其中：

上游引物5’→3’CAGAATGCGGCTGTATGAGA

下游引物5’→3’GAGCCCGCCTTAGCATCTAC。

(e)BALB/cAnSlac-Crygc-del純系的突變基因為Crygc亞基第三個外顯子1個堿基缺失突變。