[發(fā)明專利]檢測乙型肝炎病毒前S基因變異的方法和試劑

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110051079.7
• 申請日: 2011-03-03
• 公開（公告）號: CN102653799A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設計）人: 屠紅;金晏;曹志剛;朱宇;錢耕蓀
• 申請（專利權）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域；更具體地，本發(fā)明涉及檢測乙型肝炎病毒前S區(qū)基因變異的方法和試劑。

背景技術

原發(fā)性肝細胞肝癌是中國常見惡性腫瘤之一，已占居民腫瘤死亡的第二位。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是導致中國肝癌發(fā)生的首要原因。中國約有HBV表面抗原(HBsAg)攜帶者1.2億，他們中相當部分的慢性肝炎患者，經(jīng)10～20年的發(fā)展會進入肝硬化狀態(tài)，而肝硬化患者中每十年即有30～50％的人將演變成肝癌。近年來，隨著乙肝疫苗的普遍應用，中國兒童中肝炎的發(fā)病得到了很好的控制。但在那些已經(jīng)感染了乙肝病毒的人群中，肝癌的發(fā)病率和死亡率卻仍然呈上升趨勢。在HBV感染者中進行有效的肝癌高危預測，不僅能篩查出高危人員進行積極的預防干預和早診早治，而且能解除大多數(shù)相對低危人員的精神負擔，減輕醫(yī)療負擔。

HBV屬嗜肝DNA病毒科，其基因組為部分環(huán)狀雙鏈DNA，約3200bp，包括4個開放讀碼框：前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、X區(qū)以及P區(qū)，分別編碼乙肝病毒包膜蛋白、核心蛋白(HBcAg)/E抗原(HBeAg)、x蛋白以及DNA聚合酶。前S/S區(qū)為HBVDNA一個重要的開放讀碼框架。前S/S區(qū)又可分為三段，從上游開始依次為前S?1基因區(qū)、前S2基因區(qū)和S基因區(qū)。S基因編碼的226個氨基酸殘基組成的蛋白質成分含量較多，叫小蛋白(small?protein)，是乙肝病毒表面抗原的主要組成部分。前S2蛋白和S蛋白共同組成由281個氨基酸殘基組成的蛋白質，分子量居中，稱為中蛋白(middle?protein)。由前S1、前S2及S基因三部分基因區(qū)共同編碼的、由389個氨基酸殘基組成的蛋白質，是前S/S區(qū)編碼產(chǎn)物中分子量最大的一種，因此稱為大蛋白(large?protein)。前S/S區(qū)的三種編碼產(chǎn)物，不僅參與完整的乙肝病毒Dane顆粒的裝配，而且一般情況下這些產(chǎn)物都是過量產(chǎn)生的，剩余的部分還組裝成直徑為22nm的球形顆粒以及管形顆粒，在HBV感染者的血清中大量存在。前S/S區(qū)的編碼產(chǎn)物，除了在病毒及亞病毒顆粒的裝配中作為主要成分以外，還可以刺激機體產(chǎn)生中和性抗體或稱為保護性抗體，特別是由前S2區(qū)編碼的由55個氨基酸殘基組成的多肽，具有更強的免疫原性。近年來又發(fā)現(xiàn)不同形式的前S/S區(qū)產(chǎn)物具有反式激活劑的功能。如中蛋白，缺失羧基端79個氨基酸殘基后則具有反式激活功能。

由于HBV復制過程中有一獨特的逆轉錄過程，故較其它DNA病毒更易發(fā)生自然突變。隨著HBV長期持續(xù)性感染，病毒基因組突變逐漸累積，在逃避宿主免疫的同時加重對肝細胞的損傷。

前S區(qū)變異有兩種主要形式：一種為前S1或前S2區(qū)的框內缺失而致大蛋白縮短，另一種為前S2起始密碼子處點突變而致中蛋白無法合成。與慢性攜帶者相比，在不同程度的進展性肝臟疾病患者中，前S區(qū)的缺失突變發(fā)生率較高。多因素回歸分析表明，發(fā)生前S區(qū)缺失突變HBV感染的患者相對于前S區(qū)野生型的患者更容易演變?yōu)檫M展性的肝臟疾病。Meta分析研究表明，在HBV慢性感染的病程中，從無癥狀攜帶HBV者到肝硬化或肝癌患者，前S區(qū)缺失突變率次第增加；HBV前S1和前S2起始密碼子突變率在肝癌患者中顯著高于非肝癌患者。

然而，檢測HBV前S區(qū)缺失突變傳統(tǒng)上主要依賴DNA測序，該方法不僅費時長、效率低，無法滿足大樣本同時檢測的要求，而且在發(fā)生野生型和缺失性混合感染時還必須首先進行分子克隆，尤其是在有多種缺失形態(tài)存在的情況下，需挑大量克隆測序后方可得知缺失株的種類及每一種類在混合感染中所占的比例。

綜上，還需要開發(fā)更為快速、方便、準確的鑒定HBV前S區(qū)突變情況的方法和試劑。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明涉及檢測乙型肝炎病毒前S區(qū)基因變異的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明涉及檢測乙型肝炎病毒前S區(qū)基因變異的試劑和試劑盒。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測乙型肝炎病毒前S區(qū)基因變異的方法，所述方法包括：

(1)PCR擴增前S區(qū)中前S1基因區(qū)和前S2基因區(qū)，獲得擴增產(chǎn)物1，采用毛細管電泳法鑒定擴增產(chǎn)物1是否存在缺失變異；

(2)PCR擴增前S區(qū)中前S2基因區(qū)，獲得擴增產(chǎn)物2，采用限制性內切酶Nla?III酶切鑒定擴增產(chǎn)物2是否存在前S2起始密碼子點突變；

若存在以上變異形式就表明乙型肝炎病毒前S區(qū)存在核苷酸變異。

在另一優(yōu)選例中，先進行步驟(1)再進行步驟(2)；或者，先進行步驟(2)再進行步驟(1)。優(yōu)選地，先進行步驟(1)再進行步驟(2)。