[發(fā)明專利]檢測鴨瘟病毒抗體的UL55重組原核表達蛋白及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110047060.5
• 申請日: 2011-02-28
• 公開（公告）號: CN102174087A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程安春;吳英;汪銘書;陳孝躍
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物工程技術(shù)中心
• 主分類號: C07K14/03
• 分類號: C07K14/03;C07K1/14;C12N15/38;C12N15/70
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1.一種檢測鴨瘟病毒抗體的重組原核表達蛋白，其特征在于：該檢測鴨瘟病毒抗體的重組原核表達蛋白由SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列表定義；是SEQ?ID?NO：1核苷酸序列的原核表達產(chǎn)物。

2.一種檢測鴨瘟病毒抗體的原核表達蛋白的制備方法，其特征在于，包括：

(1)設(shè)計擴增DPV-UL55基因的特異性引物；

(2)通過PCR擴增獲得UL55基因片段；

(3)對UL55基因進行克隆、測序鑒定；

(4)將UL55基因定向亞克隆至pET32a原核表達載體；

(5)UL55基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達；

將重組表達質(zhì)粒pET32a-UL55轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達；

(6)UL55基因表達蛋白的純化；

(7)重組UL55蛋白的復(fù)性和檢測。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(6)具體做法為：

①待純化樣的制備

離心收集表達菌液：收集誘導(dǎo)表達的菌液離心取沉淀，將菌體沉淀用20mmolTris-HCl(pH8.0)懸浮，直接進行包涵體洗滌法純化重組ULL55蛋白的或-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

②重組ULL55蛋白的包涵體洗滌法純化

取出離心收集并用20mmolTris-HCl(pH8.0)懸浮的表達菌(-20℃保存的菌體沉淀，室溫下融化后)，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體(200w，30sec/次，5～10次)，4℃10000r/min離心10min。將沉淀用20ml洗液(10mmol/L?PBS+2mol/L尿素+1％Triton?X-100+20mMTris-HCl+2mM?EDTA)懸浮，4℃10000r/min離心10min后，沉淀再次用20ml洗液懸浮，重復(fù)洗滌五次后，用適量尿素溶液(10mmol/L?PBS+8M尿素+50mM?Tris-HCl+50mMNaCl+10％甘油)溶解沉淀，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(7)具體做法為：將包涵體洗滌純化得到的重組UL55蛋白分多次加入到復(fù)性緩沖液(50mM?Tris-HCl?pH8.0+0.15M?NaCl+1mM?EDTA+1mM?GSSG+10mM?GSSH)中，使尿素濃度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使變性蛋白逐漸復(fù)性，并控制蛋白終濃度在0.1～1mg/ml的范圍內(nèi)。4℃復(fù)性24～48h，收集稀釋復(fù)性的蛋白液，裝入透析袋4℃透析(透析緩沖液：50mMTris-HCl?pH?8.0+50mM?NaCl+0.5mM?EDTA+10％甘油+1％甘氨酸)24～48h。透析后樣品經(jīng)8000g離心15min后收集上清，取其中20μl進行SDS-PAGE分析，并以純化的的兔抗DPV為一抗，以HRP標記羊抗兔IgG為二抗進行Western?blotting檢測。其余蛋白液用Bradford法測定蛋白的最終濃度，分裝后冷凍干燥濃縮備用。