[發(fā)明專利]一種甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110044583.4
• 申請日: 2011-02-24
• 公開（公告）號: CN102183398A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳酬飛;王江海;袁建平;許紅;呂寶鳳;鄭貴洲;鄭新寧;劉權(quán);燕騰鵬;徐小明;彭娟;徐小燕
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué);廣州安能特化學(xué)科技有限公司
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)染色的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法。

背景技術(shù)

甲烷氧化菌是專性烴氧化菌菌群中的一員，是具有高度專一的、以甲烷為唯一碳源的細菌群體。甲烷氧化菌的存活依賴于持續(xù)性的甲烷供給。故表層土壤和/或沉積物中甲烷氧化菌異常的產(chǎn)生往往與深部甲烷的持續(xù)微滲漏有關(guān)，而甲烷氧化菌異常是微生物油氣勘探與微生物油氣藏表征的重要指標。

甲烷氧化菌異常的確定需要對甲烷氧化菌的數(shù)量進行高通量計數(shù)；而甲烷氧化菌數(shù)量的高通量計數(shù)需要以甲烷氧化菌體外特異性熒光染色技術(shù)為基礎(chǔ)。然而，該技術(shù)是前人尚未涉及的領(lǐng)域。

甲烷單加氧酶(pMMO)是甲烷氧化菌的特征性酶，是一種跨膜蛋白。本方法利用pMMO的膜外結(jié)構(gòu)域能與經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)標記的pMMO單克隆抗體進行特異性結(jié)合的這一特性，實現(xiàn)對甲烷氧化菌在體外的特異性熒光染色。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能在體外對甲烷氧化菌進行特異性熒光染色的方法，從而為甲烷氧化菌高通量計數(shù)做技術(shù)準備。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，pMMO作為甲烷氧化菌的跨膜特征酶，可通過膜外結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的單克隆抗體結(jié)合。

本發(fā)明的甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法，包括如下步驟：

（1）pMMO提取和純化：采用2%?(質(zhì)量/體積，g/mL)?n-十二烷基-β,D-麥芽糖苷溶解甲烷氧化菌的膜蛋白組分，然后使用吸附劑BioBeads?SM-2將變性劑n-十二烷基-β,D-麥芽糖苷吸附去除，使其濃度降低至0.2%，最后加入0.1%的變性劑Brij?58或Tween?20進行柱層析分離和純化pMMO；

（2）單克隆抗體的制備：將純化得到的pMMO進行小鼠免疫試驗，經(jīng)3次免疫和1次加強免疫后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合培養(yǎng)，篩選得到能與pMMO膜外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體；

（3）單克隆抗體的FITC熒光標記：在堿性溶液中，應(yīng)用Marsshall法標記FITC熒光抗體；

（4）甲烷氧化菌體外染色和檢測分析：將該標記抗體對甲烷氧化菌進行體外染色，最后用熒光顯微鏡對熒光強度進行分析，評價染色效果。

由于n-十二烷基-β,D-麥芽糖苷既是pMMO的最佳溶劑，同時也會抑制pMMO的活性，故不能作為柱層析分離的變性劑。本發(fā)明首先使用2%?(質(zhì)量/體積，g/mL)的n-十二烷基-β,D-麥芽糖苷徹底溶解甲烷氧化菌的膜蛋白組分，然后使用吸附劑BioBeads?SM-2將變性劑n-十二烷基-β,D-麥芽糖苷吸附去除，使其濃度降低至0.2%，此時酶活力可達到原始酶活性的88.2%，最后加入0.1%的變性劑Brij?58或Tween?20進行柱層析分離、純化pMMO。將純化得到SDS-PAGE純的pMMO進行小鼠免疫試驗，經(jīng)3次免疫和1次加強免疫后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合培養(yǎng)，篩選得到能與pMMO膜外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆單體。在堿性溶液中，應(yīng)用Marsshall法標記FITC熒光抗體后，將該標記抗體對甲烷氧化菌進行體外染色，最后用熒光顯微鏡對熒光強度進行分析，評價染色效果。

pMMO提取所用菌株是中山大學(xué)王江海研究團隊從南陽油田分離得到的甲烷氧化菌NY003菌株。具體的發(fā)酵培養(yǎng)、提取和純化過程如下：先用5L自動發(fā)酵罐培養(yǎng)甲烷氧化菌2L，離心收集菌體，超聲破碎、提取膜組分；加入pH?7.0、25?mM的MOPS緩沖液將膜組分充分懸浮，向懸浮液持續(xù)通入氮氣20?min，將溶液中的氧氣徹底驅(qū)除；加入2%?(質(zhì)量/體積，g/mL)?n-十二烷基-β,D-麥芽糖苷，混合反應(yīng)45?min后，143,000?×?g離心90?min，保留上清；加入n-十二烷基-β,D-麥芽糖苷的吸附劑BioBeads?SM-2，反應(yīng)45?min后，離心去除BioBeads；經(jīng)0.22?μm濾膜過濾后加入0.1%?Brij?58或0.1%?Tween?20后，再采用柱層析進行分離、純化。柱層析所用層析柱為POROS?20?HQ/Mcolumn?(1?cm?×?10?cm)；使用前經(jīng)pH?7.0、含0.1%?Brij?58或0.1%?Tween?20、25?mM的MOPS緩沖液進行平衡處理。