[發(fā)明專利]大麥木糖異構(gòu)酶基因的功能及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110041946.9
• 申請(qǐng)日: 2011-02-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102643845A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 頓寶慶;王智;李桂英;路明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/61
• 分類號(hào): C12N15/61;C12N15/81;C12N1/19;C12P7/06;C12P19/02;C12R1/865
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及大麥木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的功能，本發(fā)明還涉及含該基因的重組質(zhì)粒及工程菌株，以及用該工程菌通過(guò)發(fā)酵含有木糖的培養(yǎng)基制備乙醇和其他發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物的木質(zhì)纖維素中可發(fā)酵糖主要為葡萄糖和木糖，后者占木質(zhì)纖維素的25％。但是，大部分能夠發(fā)酵葡萄糖以制備乙醇的酵母(如釀酒酵母)不能夠以木糖作為碳源。如果能夠?qū)⒅参锏哪举|(zhì)纖維素中的木糖異構(gòu)化，生成木酮糖，木糖就可以作為碳源進(jìn)行乙醇發(fā)酵。而若能找到高效的木糖異構(gòu)酶(D-xylose?isomerase，XI)，催化五碳糖D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，便可達(dá)到此目的。

現(xiàn)有技術(shù)的木糖異構(gòu)酶基因多來(lái)自于微生物。如Escherichia?coli，Bacillus?subtilis，Thormotoga?species，Thermus?species等等。但迄今為止只有少數(shù)幾種且多為嗜熱細(xì)菌的木糖異構(gòu)酶基因在乙醇生產(chǎn)傳統(tǒng)菌株釀酒酵母中得到活性表達(dá)，而且在30℃左右的乙醇發(fā)酵溫度下普遍由于活性太低而成為木糖代謝途徑的限速步驟。

因此，發(fā)現(xiàn)新的可在釀酒酵母里高效表達(dá)的木糖異構(gòu)酶，提供能夠轉(zhuǎn)化木糖生成木酮糖的酵母工程菌，并能克服現(xiàn)有技術(shù)的限制，即在30℃左右的乙醇發(fā)酵溫度下具有足夠的酶活，很有必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是從大麥中篩選出新的木糖異構(gòu)酶基因，并將該基因?qū)脶劸平湍福顾玫降慕湍高z傳工程菌獲得將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。

本發(fā)明人通過(guò)分析數(shù)據(jù)庫(kù)大麥基因組序列的方式，首次從大麥基因組序列中發(fā)現(xiàn)了具有木糖異構(gòu)化功能的基因(GenBank?NO.X95257)，并將其命名為“大麥木糖異構(gòu)酶基因”。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的木糖異構(gòu)酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)后，賦予宿主細(xì)胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。

現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)僅在轉(zhuǎn)錄水平上證實(shí)了基因(GenBank?NO.X95257)的存在，但未公開(kāi)過(guò)其所具有的任何功能，以及可利用該基因做何種用途的研發(fā)。

本發(fā)明構(gòu)建了具有大麥木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入了釀酒酵母中，獲得了一種新的酵母工程菌。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，原來(lái)不具備轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的能力的釀酒酵母賦予了該轉(zhuǎn)化能力。

本發(fā)明進(jìn)行了如下具體工作：

1.提取大麥mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用保守引物克隆得大麥木糖異構(gòu)酶基因，其大小為1443bp。

2.將大麥木糖異構(gòu)酶基因片段連接到pYES2質(zhì)粒載體中，構(gòu)建具有完整木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-WXI。

3.將含大麥木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-WXI通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入不具將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力的釀酒酵母中，獲得能夠?qū)⒛咎寝D(zhuǎn)化為木酮糖的遺傳工程酵母菌株W(詳見(jiàn)實(shí)施例5)。

因此本發(fā)明的木糖異構(gòu)酶基因有益效果是：大麥木糖異構(gòu)酶基因賦予宿主細(xì)胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。且大麥木糖異構(gòu)酶基因工程菌株的木糖利用率可達(dá)51.78％，大大高于對(duì)照菌株(詳見(jiàn)實(shí)施例6)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中所舉的質(zhì)粒、菌株只是用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容加以限制。實(shí)際上，用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的基因和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到其它多種具有將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖能力的遺傳工程菌株，均不能脫離本發(fā)明的精神和思路。

以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

試驗(yàn)材料和試劑

1、菌株及載體：釀酒酵母表達(dá)載體pYES2購(gòu)自Invitrogen公司，釀酒酵母菌株CEN.PK113-5D(表型為：MatA?ura3-52)及大腸桿菌DH5α由所在實(shí)驗(yàn)室保存。

2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶及連接酶購(gòu)自NEB公司，其它試劑如未作具體說(shuō)明都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到)。

3、培養(yǎng)基：

(1)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；

(2)酵母培養(yǎng)基YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，平板添加2％瓊脂)；

(3)選擇培養(yǎng)基SC(0.67％YNB、2％葡萄糖，平板添加2％瓊脂)。

實(shí)施例1獲取大麥cDNA

(一)植物總RNA提取-Trizol法