[發明專利]一種抑制免疫及治療移植物抗宿主病（GVHD）制劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201110041925.7
• 申請日: 2011-02-21
• 公開（公告）號: CN102641296A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 顧麗婭;楊子江;顧茂健
• 申請（專利權）人: 楊子江
• 主分類號: A61K35/14
• 分類號: A61K35/14;A61K35/28;A61K35/12;C12N5/0775;A61P37/06
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)的制劑的制備方法，其特征在于，該制劑的制備方法包括如下步驟：

1)從健康人血液中通過白細胞置換獲取外周血單核細胞，或從骨髓中(通過密度梯度離心的方法，可選步驟)獲取骨髓單核細胞，或從人脂肪吸取物中直接提取MSC；

2)篩選及培養外周血或骨髓單核細胞以獲得MSC細胞；

3)在特定條件下培養MSC細胞使其分泌促組織修復和再生的生長因子和細胞活素，分離MSC細胞和培養基，獲得富含促血管生成因子和細胞活素的無細胞培養基；

4)對步驟3)中所獲得的無細胞培養基進行后處理，該后處理步驟包括：過濾細胞碎片、純化該無細胞培養基、檢測各有效生長因子的成分及含量、對該培養基進行凍干處理或冷凍保存，即獲得抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)的制劑。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的健康人血液或骨髓的來源可以是自體來源或異體來源，獲得途徑可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血庫直接購買的健康人外周血白細胞懸液樣本，或通過臨床白細胞置換。

3.根據權利要求1-2任一所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的從血液中或骨髓中通過密度梯度離心獲取外周血單細胞的方法為：使用梯度劑為Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同類產品，溫度為15～25℃，離心力為200g-500g，時間20-40分鐘，離心完成后，吸取當中不透明層，即為單核細胞懸液。

4.根據權利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中的培養單核細胞以獲得MSC細胞時，所用的培養基為M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一種，并添加有heparin(0-100U/ml)，培養基中另可含有質量比為5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清，在預設條件為培養溫度37℃，二氧化碳濃度為5-7％的細胞培養箱中培養。

5.根據權利要求1-4任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的培養單核細胞以獲得MSC細胞的方法為以下所述方法①、②、③或④中的一種：

方法①：將單核細胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶個細胞的密度培養1-2天，去除懸浮細胞，將貼壁的細胞繼續培養7-21天，獲I型MSC。

方法②：將單核細胞與fibrin微球共同培養1-2天，每100-1000mg?fibrin微球可吸附1×10⁶至1×10⁸個細胞的密度，去除懸浮細胞，將附著于fibrin微球的細胞繼續培養7-21天，獲I型MSC。

方法③：將單核細胞通過CD14，或CD45特異性抗體進行磁珠分選，篩選出不含CD14或CD45的單核細胞亞群，將此CD14^-或CD45^-單核細胞亞群以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶個細胞的密度培養1-2天(或用方法②培養)，去除懸浮細胞，將貼壁(或附著于fibrin微球)的細胞繼續培養7-21天，獲II型MSC。

方法④：將人脂肪吸取物50-100ml在pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或0.9％的醫用生理鹽水中洗凈，用I型和II型膠原酶消化(酶的濃度范圍0.05％-0.1％)，消化步驟為置于37℃條件下震蕩30-60分鐘。將消化分散后的單核細胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶個細胞的密度培養1-2天(或用方法②培養)，將貼壁(或附著于fibrin微球)細胞繼續培養7-21天，獲III型MSC。