[發(fā)明專利]晶胞粘連控制基因簇的克隆及在防止晶體降解中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110041444.6
• 申請日: 2011-02-21
• 公開（公告）號: CN102643833A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫明;朱義廣;紀(jì)芳;尚卉;朱倩;王鵬霞;徐承晨;鄧運(yùn);付菁菁
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/32;A01N63/02;A01P7/04
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬農(nóng)業(yè)微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及晶胞粘連表型控制基因簇的分離、克隆以及它編碼的產(chǎn)物在防止晶體蛋白降解中的應(yīng)用，本發(fā)明還與微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)。

背景技術(shù)

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis，Bt)是一種廣泛存在于各種生態(tài)環(huán)境中的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌。該物種最大的特點(diǎn)就是在其生長周期中能形成內(nèi)生芽胞的休眠體，并且在其芽胞形成的同時能產(chǎn)生對許多昆蟲具有特異毒性的由殺蟲晶體蛋白(Insecticidal?Crystal?Proteins，ICPs)組成的伴胞晶體。這些殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲綱10個目500多種昆蟲以及原生動物、線形動物門、扁形動物門中某些有害種類也有特異的生物活性(Schnepf?H?E，Crickmore?N，Rie?J?V，Lereclus?D，Baum?J，F(xiàn)eitelson?J，Zeigler?D?R，Dean?D?H.1998.Bacillus?thuringiensis?and?its?pesticidal?crystal?proteins.Microbiol?Mol?Biol?Rev，62：775-806)。由于蘇云金芽胞桿菌對多種昆蟲都有很高的殺蟲活性，而且具有對環(huán)境和人蓄無損害等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛地應(yīng)用于生物農(nóng)藥的開發(fā)。目前，基于蘇云金芽胞桿菌開發(fā)的生物殺蟲劑已經(jīng)成為最成功的一種生物農(nóng)藥，占到了整個生物農(nóng)藥行業(yè)90％以上的市場，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和倉儲等害蟲的防治。

B.thuringiensis的伴胞晶體是在芽胞形成期(sporulation)合成并累積而成。芽胞的形成可分為7個時期，一般在芽胞形成的第二期晶體蛋白開始表達(dá)，隨著芽胞的進(jìn)一步發(fā)育，晶體蛋白逐漸累積，并形成具有晶格結(jié)構(gòu)的伴胞晶體。當(dāng)芽胞成熟以后，母細(xì)胞自溶，釋放出芽胞和伴胞晶體。在絕大多數(shù)B.thuringiensis中，伴胞晶體是在母細(xì)胞中形成的，在空間上與芽胞無關(guān)。一旦芽胞成熟并且細(xì)胞自溶后，芽胞和伴胞晶體都釋放出來，彼此相互獨(dú)立。在少數(shù)B.thuringiensis的亞種中，芽胞成熟母細(xì)胞自溶后，伴胞晶體和芽胞彼此不分離，光學(xué)顯微鏡鏡下觀察兩者是粘連在一起的(簡稱晶胞粘連)，例如幕蟲亞種(Ji?F，Zhu?Y，Ju?S，Zhang?R，Yu?Z，Sun?M.2009.Promoters?of?crystal?protein?genes?do?not?control?crystal?formation?inside?exosporium?of?Bacillus?thuringiensis?ssp.finitimus?strain?YBT-020.FEMS?Microbiol?Lett，300(1)：11-17)。

蠟狀芽胞桿菌群(包括蠟狀芽胞桿菌(B.cereus，簡稱Bc)、炭疽芽胞桿菌(B.anthracis，簡稱Ba)和蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis，簡稱Bt))與B.subtilis相比，其芽胞結(jié)構(gòu)有一個明顯的差異，前者在芽胞衣(coat)外還有一層芽胞外壁(exosporium)(Henriques?A?O，Moran?C?P?Jr?2007.Structure，assembly，and?function?of?the?spore?surface?layers.Annu?Rev?Microbiol，61：555-588)。大多數(shù)B.thuringiensis的伴胞晶體是在芽胞外壁外側(cè)形成的，而幕蟲亞種的伴胞晶體則在芽胞外壁和芽胞衣之間形成，從而導(dǎo)致晶胞粘連表型的產(chǎn)生。

目前，蘇云金芽胞桿菌應(yīng)用主要包括兩個途徑，一種是將蘇云金芽胞桿菌的殺蟲晶體蛋白基因轉(zhuǎn)入植物中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治(Pigott?CR?and?Ellar?DJ.2007.Role?of?receptors?in?Bacillus?thuringiensis?crystal?toxin?activity.Microbiol?Mol?Biol?Rev?71：255-281)；另一種是做成可以在環(huán)境中釋放的生物殺蟲劑。在戶外使用過程中，由于晶體蛋白本身對紫外線敏感，在環(huán)境中容易被降解掉從而降低殺蟲的活性。讓殺蟲晶體蛋白定位于芽胞外壁的內(nèi)側(cè)，制成生物囊殺蟲劑，是一種具有潛力的防止晶體過快降解的方法；當(dāng)母細(xì)胞裂解后形成晶胞粘連，在環(huán)境中釋放時由于受到芽胞外壁的保護(hù)，可以延長作用時間。對于晶胞粘連機(jī)制的研究為這種設(shè)想可以提供理論基礎(chǔ)。