[發明專利]羊膜復合角膜緣干細胞膜片的制備方法

有效

• 申請號: 201110036633.4
• 申請日: 2011-02-12
• 公開（公告）號: CN102166374A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 周慶軍;史偉云;謝立信;王瑤;楊玲玲
• 申請（專利權）人: 山東省眼科研究所
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;C12N5/074
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明屬于眼角膜緣干細胞培養領域，具體涉及到一種羊膜復合角膜緣干細胞膜片的制備方法。

背景技術

角膜上皮細胞來自于角膜緣部位的干細胞，正常角膜緣是維持正常眼表功能的關鍵。角膜緣受損后，使損傷區干細胞功能缺陷或數量不足，會引起結膜上皮長入角膜表面，角膜新生血管生成，進一步引起角膜瘢痕等嚴重癥狀，使視力明顯下降甚至喪失。而通過移植補充一定數量的干細胞是目前最有效的治療方法之一。

角膜緣移植由于受到材料來源限制和術后免疫排斥等難題的制約，培養的角膜緣干細胞移植成為眾多學者研究的熱點。在以角膜緣干細胞缺乏或功能障礙為特征的疾病治療過程中，培養的角膜緣干細胞移植術已成為眼科研究的一個新的發展方向。培養的角膜緣干細胞移植部分解決了供體不足的問題，它的臨床應用將為眼表疾病的治療開辟廣闊前景，具有深遠意義。目前常用的用于移植的角膜緣干細胞培養方法主要由兩種，一種是將羊膜平鋪于細胞培養器皿或載玻片表面，其獲得的細胞膜片移植前需要從培養器皿上揭取下來，非常容易揭破，影響臨床使用，同時應用此方法無法與飼養層細胞共培養，也會導致干細胞數量的丟失，影響移植后的效果；另一種方法是將羊膜用乳膠圈固定于嵌入式培養板小室(transwell或insert)中，但此方法在培養后期會因為羊膜松弛而造成培養上皮復層不均勻的缺點，而大大影響臨床手術治療的效果。

發明內容

本發明的目的是提供一種羊膜復合角膜緣干細胞膜片的嵌套式培養方法，以彌補現有技術的不足。

本發明的制備方法如下：首先，按照常規方法制備5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮無菌羊膜片，再將上述得到的羊膜片的上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒的端面上，用嵌入式培養小室扣在套筒的羊膜片上，即制成羊膜嵌套式培養模具；然后用絲裂霉素C處理小鼠胚胎成纖維細胞后，再消化接種到細胞培養用的6孔板中制備小鼠胚胎成纖維細胞飼養層，將上述制好的羊膜嵌套式培養模具放置入鋪有上述飼養層的6孔板的孔內，最后用中性蛋白酶、0.25％胰酶/0.02％EDTA消化而制備角膜緣干細胞細胞懸液，并接種于羊膜上皮面，每套培養模具接種2.0-3.0×10⁵個角膜緣干細胞，培養10日后長滿角膜緣干細胞即可用，即制得羊膜復合角膜緣干細胞膜片。

使用時，將套筒從嵌入式培養小室中取出，輕輕將羊膜復合角膜緣干細胞膜片取下即可用于臨床角膜緣干細胞移植手術。

本發明以眼庫剩余角膜環為原材料，培養制備羊膜復合角膜緣干細胞膜片，用于角膜緣干細胞缺乏或功能障礙為特征的疾病移植治療中。

本發明的羊膜嵌套式培養模具應用于制備羊膜復合角膜緣干細胞膜片，相比以往羊膜平鋪法和乳膠圈羊膜固定法，本發明的嵌套式培養具有如下優點：羊膜培養面很平，可使角膜緣干細胞復層更為均勻，臨床應用方便且羊膜不易破裂。

附圖說明

圖1、羊膜嵌套式培養模具基本結構示意圖。

其中，1嵌入式培養板小室，2套筒，3羊膜片。

具體實施方式

本發明以眼庫剩余角膜環為原材料，制備成了羊膜為基底膜的羊膜復合角膜緣干細胞膜片，具有角膜緣干細胞的特性，用于角膜緣干細胞缺乏或功能障礙為特征疾病的移植治療中。

本發明的制備方法：

一、羊膜嵌套式培養模具的制備：

如圖1，按照常規方法制備5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮無菌羊膜片3，將該羊膜片3上皮面朝上平鋪于6孔培養板中；將上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培養小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培養模具。其中所用套筒2外徑24mm，高16mm。

二：小鼠胚胎成纖維細胞飼養層的制備：

用0.01mg/ml絲裂霉素C溶液處理貼壁的小鼠胚胎成纖維細胞，37℃孵育2小時；用10ml?PBS磷酸鹽緩沖液仔細清洗細胞后；加1ml?0.25％胰酶/0.02％EDTA，37℃孵育3-5分鐘；加9ml含血清的DMEM培養液中止消化，吹打細胞；離心收集細胞，棄上清，用10ml含胎牛血清的DMEM培養液重懸細胞；細胞計數，以2.5×10⁴細胞/cm²的細胞密度接種細胞到6孔培養板中，37℃培養過夜使其貼壁，即制備成小鼠胚胎成纖維細胞飼養層。

三、角膜緣干細胞懸液制備：