[發明專利]大規模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法

有效

• 申請號: 201110032128.2
• 申請日: 2011-01-29
• 公開（公告）號: CN102174068A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 李弘劍;鄭飛;冉艷紅;蘇正定;周天鴻
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;C07K1/20;C07K1/12
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明涉及一種蛋白質純化方法，特別涉及一種大規模純化含有His?Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法與應用。

背景技術

目前，多肽的制備方法主要包括化學合成法和基因工程法。對于氨基酸數目不大以及需量較小的多肽，可以通過化學合成法合成。但是，對于氨基酸數目較多的多肽用化學方法合成難度大，成本高，而且周期也長，譬如100mg純度大于95％的樣品需要420元左右人民幣一個氨基酸，按50個左右氨基酸需要2萬多元，而純度大于98％需要800元人民幣每個氨基酸，按50個氨基酸計算需要4萬元，而且需要4周左右時間。因此要大量獲得高純度以及氨基酸數目較多的目的肽，采用基因工程方法成本遠遠低于化學合成法。

基因工程方法表達多肽需要考慮到菌體對外源基因的容忍度、表達方式以及純化工藝。因此，現有多肽的構建過程中通常添加標簽，構成融合蛋白，這不僅是為了增大多肽的分子量，相對降低其在菌體中的降解速度，而且有利于純化，降低成本。由于標簽可能會影響目的多肽的功能，因此，一般會在標簽與目的多肽之間加入酶解位點，純化工藝后期通過酶解釋放目的多肽。其中，甲酸水解((Asp↓Pro/Gly)位點是實驗室常用的一個酶解位點，純化后的融合蛋白通過甲酸水解釋放出目的多肽。相對于需用引入酶進行酶解的位點，譬如腸激酶酶解位點，甲酸水解位點由于使用甲酸得到目的多肽，沒有引入新的蛋白污染，后續純化工藝更為簡單，成本更低。但是，目前沒有關于利用甲酸水解方法來大規模水解融合蛋白制備多肽的報道，這可能是由于甲酸水解條件控制不好容易引起非特異性剪(Expression，purification?and?structural?studies?of?ashort?antimicrobial?peptide.Biochimica?et?Biophsica?Acta：1788(2009)314-323)，造成副產物增加，從而得率低。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種簡單、低成本、高效率、高純度，中間過程可以時實定量、監控、分析的大規模純化含有His?Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法。所述的大規模為目的多肽得率為g級別的規模。

本發明的另一目的在于提供上述方法的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種大規模純化含有His?Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法，為首先利用Ni²⁺親和層析分離得到融合蛋白，然后用甲酸水解融合蛋白，然后再通過Ni²⁺親和層析去除未水解的融合蛋白，得到純化的目的多肽；具體包括以下步驟：

(1)對表達含有His?Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的工程菌發酵液進行預處理，得到含有His?Taq和甲酸水解位點的融合蛋白粗提物：

①含有His?Taq和甲酸水解位點的融合蛋白為分泌形式表達時，則去除工程菌發酵液中的固體物質，收集發酵上清液，對發酵上清液進行濃縮；

②含有His?Taq和甲酸水解位點的融合蛋白為包涵體形式表達時，則收集工程菌菌體，進行破碎，然后將包涵體進行變性，溶解于溶液中；

所述的工程菌優選為細菌，更優選為大腸桿菌；

(2)融合蛋白粗提物的初次純化

A、用含10～20mM咪唑的溶解緩沖液A平衡Ni-NTA柱至基線穩定，然后將步驟(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速為3～6ml/min，Ni-NTA柱的載量為25～35mg蛋白/ml柱體積；上柱完后，用含10～20mM咪唑的溶解緩沖液A洗柱子至基線，然后用含250～500mM咪唑的溶解緩沖液A洗脫至基線停止，收集蛋白峰處的洗脫液；最后用含1M咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，將殘留在柱上的蛋白和其它雜質全部洗脫下來，再用去離子水沖洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重復利用；所述的溶解緩沖液A的組成為：6M尿素、25～50mM?Na₂HPO₄、300～500mM?NaCl，pH?8.0；所述去離子水的用量優選為至少4倍柱體積；