[發明專利]一種重組泛素連接酶PTB-U-box融合基因及其表達載體和用途

有效

• 申請號: 201110031855.7
• 申請日: 2011-01-28
• 公開（公告）號: CN102174550A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 藥立波;李霞;王秦豪;茹懿;申亮亮;張璟
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/79;C12N15/861;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及基因重組及其表達，特別涉及一種重組泛素連接酶PTB-U-box融合基因及其表達載體和用途。

背景技術

1、CHIP的概述

CHIP(Carboxy?terminus?of?Hsc70?Interacting?Protein)是一類進化保守的、廣泛分布的胞漿蛋白，最初被認為是一種共伴侶蛋白(co-chaperone)。由于其分子中含有一個U-box結構域，因此本質上又屬于一類E3泛素連接酶。CHIP通過促進蛋白質的泛素化、降解，在蛋白質質量控制、穩定性調控過程中起著重要的作用。在乳腺癌組織中，CHIP的表達與腫瘤分級呈負相關；實驗證據還表明CHIP可以抑制腫瘤的增殖和轉移。這些研究提示增強CHIP的作用有可能作為一種新的腫瘤治療策略。

1)CHIP含有一個TPR結構域以及一個U-box結構域

CHIP蛋白由N末端開始，分別由TPR結構域(tetratricopeptide?repeatdomain)、Linker和U-box結構域構成。TPR結構域介導蛋白-蛋白相互作用，能夠與熱休克蛋白Hsc70/Hsp70、Hsp90C末端相互識別并結合，調控熱休克蛋白底物/客戶蛋白的折疊過程；Linker的功能尚不明確，目前只了解它對于TPR依賴的相互結合是必需的；C端的U-box結構域賦予了CHIP泛素連接酶活性，負責募集泛素結合酶E2并將結合在E2上的泛素轉移至TPR結構域所結合的伴侶分子及其底物蛋白上，促進這些分子在蛋白酶體中降解。

2)CHIP分子作為共分子伴侶和一類泛素連接酶，是細胞內蛋白質折疊-重折疊機器和泛素-蛋白酶體系統這兩種通路之間的分子樞紐，參與細胞內蛋白質質量控制

細胞依賴蛋白質質量控制系統(protein?quality?control，QC)來持續監測新生肽鏈的折疊和錯誤折疊蛋白的修復或降解，以維持細胞的穩態。QC由分子伴侶(包括Hsp70、Hsp40等)和泛素-蛋白酶體系統組成，前者幫助新生肽鏈的折疊與重折疊，后者負責降解錯誤折疊或損傷的蛋白。

CHIP作為一種共分子伴侶，能夠借助其TPR結構域與分子伴侶Hsp70C末端相互結合，調節分子伴侶Hsp70家族成員與底物蛋白的結合和釋放；另外，CHIP與Hsp70結合后能夠阻止Hsp70的折疊，并依賴其U-box結構域和泛素連接酶活性促進底物蛋白的降解。通過上述方式，CHIP直接參與細胞內蛋白質的質量控制。

3)新近研究提示CHIP具有抑制腫瘤細胞增殖和轉移的作用

CHIP分布廣泛，尤其在代謝活躍的組織中其表達水平很高，如骨骼肌、心臟和腦。在細胞中，CHIP主要定位在胞質內，也有少部分存在于核中。最近的研究表明，在人乳腺癌組織中，CHIP的表達水平與腫瘤惡性程度和分級反相關。機制研究和細胞實驗表明，CHIP通過促進多種致癌蛋白例如HER2、ER-a、GR、SRC-3等的泛素化、降解，從而抑制腫瘤的增殖和轉移。

2、重組泛素連接酶的應用

在泛素化過程中泛素連接酶E3負責特異性識別與結合底物。近年來多個研究組應用重組技術構建重組泛素連接酶，成功降解正常情況下并非泛素化系統天然底物的某些蛋白。例如通過修飾泛素連接酶復合物Skp1-Cullin1-F-box(SCF)的底物結合亞單位F-box構成的重組F-box蛋白CFP，可靶向性降解pRB和β-catenin。將分別來自BRCA1和BARD的兩個RING與增殖細胞核抗原PCNA進行重組后，該重組分子以蛋白酶體依賴的方式降低p57蛋白的水平，并且下調其功能。而李霞等的研究也表明，利用Cb1構建的重組泛素連接酶能夠有效的下調乳腺癌細胞中高表達的HER2，從而達到抑制腫瘤生長的目的。這些研究證實利用重組的泛素連接酶，可靶向性地降解一些疾病相關分子。但目前還沒有利用CHIP泛素連接酶活性構建重組泛素連接酶進行基因治療研究的相關報道。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種重組泛素連接酶PTB-U-box融合基因及其表達載體和用途，構建基于CHIP的泛素連接酶活性區域構建融合基因，所構建的融合基因具有靶向性的泛素化和降解功能，可用于抗腫瘤的藥物的制備或進行基因治療。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種重組泛素連接酶PTB-U-box融合基因，是將IRS-1的PTB結構域基因與CHIP的U-box結構域基因連接。

所述的重組泛素連接酶PTB-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。