[發明專利]一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201110030149.0
• 申請日: 2011-01-27
• 公開（公告）號: CN102618625A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 王思賢;李洪敏;高華方;魏運榮
• 申請（專利權）人: 博奧生物有限公司;中國人民解放軍第三O九醫院;清華大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法和試劑盒。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis，MTB)所致的一種傳染性疾病。據世界衛生組織(WHO)提供的數據，2002年世界結核病的形勢為：感染人數約30億，新發結核病例880萬。其中，新涂陽結核病例390萬，發病率比2001年增長1.1％，新發病例中耐多藥比例為3.2％，結核病的死亡人數達180萬。回顧性調查結果表明，中國MTB的總耐藥率為27.8％，初始耐藥率和獲得耐藥率分別為18.6％和46.5％，耐多藥率為10.7％，其中初始和獲得性耐多藥率分別為7.6％和17.1％。由于耐藥結核桿菌的流行，使結核病成為由單一微生物導致死亡的主要原因，占世界人口數的7％，占可預防死亡數的26％。

隨著分子生物學理論和技術的發展，MTB的耐藥機制及耐藥的分子基礎逐步被闡明，建立了快速檢測MTB耐藥基因的方法，為MTB快速藥物敏感性試驗開辟了一條新的途徑。研究表明MTB產生耐藥性機制包括藥物失活酶、胞壁通透性改變、靶結構基因突變和代謝途徑改變等，而主要機制是菌內藥物作用靶基因的突變所致。利福平和異煙肼是治療結核最主要的一線藥物，通過各種分子生物學工具對這兩種藥物的耐藥性的遺傳基礎進行了深入研究，結果顯示，在正常情況下，利福平(RFP)與RNA聚合酶B亞基(rpoB)特異性結合，通過阻斷RNA的合成而起到抑制細菌生長的作用，rpoB基因在利福平的藥物選擇壓力下發生突變而改變所編碼的rpoB亞基構象，從而降低與利福平的親和力。rpoB基因突變一般發生在該基因內一個高度保守的81bp區域內(507-533位27個氨基酸密碼子)。其中最常見的密碼子突變點為531位絲氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)(531TCG→TTG)，526位組氨酸(His)→酪氨酸(Tyr)(526CAC→GAC)，此外，常見的點突變還有511CTG→CCG，533CTG→CCG(Taniguchi?H.Molecularmechanisms?of?multidrug?resistance?in?Mycobacterium?tuberculosis[J].J?Uoch，2000，22(3)：269-282)。

異煙肼耐藥性的分子基礎比較復雜，已發現幾個涉及異煙肼體內代謝過程中活性中間體形成有關的基因，其中與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG和/或烯酰基還原酶編碼基因inbA等基因突變有關。這兩種酶都直接或間接的參與異煙肼中間體的形成。

katG基因常見的密碼子突變點為第315發生突變(315AGC→ACC、315AGC→AAC，Herrara?L，Valverde?A，Saiz?P，et?al.Molecular?characterization?ofisoniazid-resistant?mycobacterium?tuberculosis?clinical?strains?isolated?inthe?Philippines[J].Int?J?Antimicrob?Agents，2004，23(6)572-576.)它的發生頻率約為67.2％。inhA基因的耐異煙肼突變主要發生在其啟動子區的-15T位脫氧核糖核苷酸(inhA基因在其啟動子區的-15C突變為T，Basso?LA，Zhang?R，Musser?JM，et?al.Mechanisms?of?isoniazid?resistance?in?Mycobacterium?tuberculosis：enzymatic?characterization?of?enoyl?reductase?mutants?identified?inisoniazid-resistant?clinical?isolates[J].J?Infect?Dis，1998，178(3)：769-775.)上。

結核分枝桿菌的臨床檢測一直以來主要依靠藥物敏感試驗，但傳統的在固體培養基上進行的藥物敏感試驗周期長。敏感性低，嚴重影響了患者的早期診斷和治療。

生物學方法為耐藥結核病的快速檢測打開了廣闊的前景。在許多的核酸擴增方法中，PCR方法被最廣泛地應用于臨床結核的檢測。

目前常用的結核桿菌基因突變檢測方法如下：

(1)DNA測序法(DNA?sequencing)對耐藥基因片段的PCR產物進行直接測序，然后與標準敏感菌株的同一DNA片段比較，分析堿基突變的位置與分布，但是此方法比較繁瑣，且所需設備多集中在一些大的測序公司，難于普及。