[發(fā)明專利]一種硫酸銅快速定量分析發(fā)酵液提取物中長(zhǎng)鏈二元酸含量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110028098.8
• 申請(qǐng)日: 2011-01-26
• 公開（公告）號(hào): CN102183514A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林日輝;余運(yùn)玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西民族大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及二元酸發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體地，涉及一種利用硫酸銅比色法快速定量分析發(fā)酵液提取物中長(zhǎng)鏈二元酸的方法。

背景技術(shù)

長(zhǎng)鏈二元酸(long?chain?dicarboxylic?acids，DCAs)是指碳鏈中含有10個(gè)以上碳原子的脂肪族二元羧酸。長(zhǎng)鏈二元酸是重要的有機(jī)酸產(chǎn)品，用于合成高性能工程塑料尼龍1212、高檔服裝用尼龍熱熔膠和高級(jí)涂料等，市場(chǎng)需求量相當(dāng)大。用化學(xué)法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸存在技術(shù)、設(shè)備要求，高能耗大等缺點(diǎn)，而且一些長(zhǎng)鏈二元酸也難以用化學(xué)方法制備，目前長(zhǎng)鏈二元酸的生產(chǎn)逐步采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行。在長(zhǎng)鏈二元酸發(fā)酵過(guò)程中，必須經(jīng)常性的對(duì)發(fā)酵液中長(zhǎng)鏈二元酸含量進(jìn)行分析，以合理的控制發(fā)酵進(jìn)程。對(duì)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)酸量分析可以采用氣相色譜法、薄層色譜法、以及NaOH滴定法，其中氣相色譜法需使用價(jià)格昂貴的氣相色譜儀、還需對(duì)長(zhǎng)鏈二元酸進(jìn)行衍生處理，不但成本高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，而且對(duì)系統(tǒng)的各項(xiàng)要求也很高(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所烴代謝組.微生物的正烷烴代謝Ⅰ假絲醉母的正烷經(jīng)代謝產(chǎn)物的研究.微生物學(xué)報(bào)，1981，21(1)：88-95)；薄層色譜法同樣也存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、儀器設(shè)備要求高的問(wèn)題(王麗華等.薄層色譜法分析十三碳二元酸及其單、雙甲酯.石油化工高等學(xué)校學(xué)報(bào)，2003，16(2)：29-32)。NaOH滴定法由于操作簡(jiǎn)單，常用于發(fā)酵過(guò)程粗提產(chǎn)品中長(zhǎng)鏈二元酸的快速分析，但滴定法存在較大誤差一直難以克服。李占朝等研究表明：為了獲得較準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，需要經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取其平均值(李占朝.十二碳二元酸的重結(jié)晶精制工藝研究.北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009，17-26.)。此外，發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸粗提工藝大多采用酸沉淀法，直接利用NaOH滴定計(jì)算二元酸產(chǎn)量，提取物中無(wú)機(jī)酸殘留也會(huì)造成較大誤差。因此，研究建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的長(zhǎng)鏈二元酸檢測(cè)方法，可供實(shí)驗(yàn)研究及實(shí)際生產(chǎn)的分析檢測(cè)所需。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用硫酸銅比色法快速定量分析發(fā)酵液提取物中長(zhǎng)鏈二元酸的方法。通過(guò)長(zhǎng)鏈二元酸與硫酸銅-甲醇溶液的Cu²⁺反應(yīng)形成沉淀，離心去除沉淀后，在600-850nm檢測(cè)上清液吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算長(zhǎng)鏈二元酸的含量。

本發(fā)明包括發(fā)酵長(zhǎng)鏈二元酸樣品的制備，比色法快速分析長(zhǎng)鏈二元酸含量?jī)刹糠帧２僮鞑襟E如下：

(1)發(fā)酵長(zhǎng)鏈二元酸樣品的制備

取體積為V₁的發(fā)酵液加1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.5、60℃下振蕩30min使長(zhǎng)鏈二元酸充分溶于水相中。離心使發(fā)酵液中固相、水相及發(fā)酵剩余烷烴分離，取出體積為V₂的水相部分，用6mol/L?HCl調(diào)pH值至2.0，加入2倍V₂體積的乙醚進(jìn)行抽提，分相后乙醚萃取液倒入燒杯中，再以2倍V₂體積的乙醚重新萃取一次，合并萃取液，在通風(fēng)櫥中吹去乙醚，得到白色固體即為長(zhǎng)鏈二元酸粗提物。

(2)比色法快速分析長(zhǎng)鏈二元酸含量

①配制硫酸銅-甲醇溶液：稱取1g硫酸銅加入干燥的錐形瓶中，量取20-200mL甲醇與硫酸銅混合，搖勻，至硫酸銅完全溶解。

②檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：取硫酸銅-甲醇溶液進(jìn)行光譜掃描，以最強(qiáng)吸收峰波長(zhǎng)為檢測(cè)分析波長(zhǎng)。對(duì)空白測(cè)定20次，方法的檢出限(3s/k)為0.011mg/mL。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精確稱量標(biāo)準(zhǔn)十二烷二酸25、50、75、100、125、150、175、200mg，加入5mL硫酸銅-甲醇反應(yīng)溶液，使標(biāo)準(zhǔn)十二烷二酸濃度分別為5、10、15、20、25、30、35、40mg/mL(每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣設(shè)3個(gè)平行)，常溫120rpm振蕩反應(yīng)10-60min，5000rpm離心10min，取上清液于820nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以O(shè)D₈₂₀為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)十二烷二酸含量為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，線性回歸方程為C₁＝-91.185×OD₈₂₀+101.66，決定系數(shù)R²＝0.9920。

④樣品中長(zhǎng)鏈二元酸含量分析：將一定量的待測(cè)物加入到5mL硫酸銅-甲醇反應(yīng)監(jiān)測(cè)溶液中，常溫120rpm振蕩反應(yīng)10-60min，5000rpm離心10min，取上清液于820nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程中，即可計(jì)算出檢測(cè)反應(yīng)液中長(zhǎng)鏈二元酸的含量。根據(jù)以下公式即可算出發(fā)酵液中長(zhǎng)鏈二元酸含量(以十二烷二酸為標(biāo)準(zhǔn))：