[發明專利]一種硫酸銅快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸含量的方法

無效

• 申請號: 201110028098.8
• 申請日: 2011-01-26
• 公開（公告）號: CN102183514A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 林日輝;余運玲
• 申請（專利權）人: 廣西民族大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及二元酸發酵技術領域的檢測方法，具體地，涉及一種利用硫酸銅比色法快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸的方法。

背景技術

長鏈二元酸(long?chain?dicarboxylic?acids，DCAs)是指碳鏈中含有10個以上碳原子的脂肪族二元羧酸。長鏈二元酸是重要的有機酸產品，用于合成高性能工程塑料尼龍1212、高檔服裝用尼龍熱熔膠和高級涂料等，市場需求量相當大。用化學法生產長鏈二元酸存在技術、設備要求，高能耗大等缺點，而且一些長鏈二元酸也難以用化學方法制備，目前長鏈二元酸的生產逐步采用微生物發酵法進行。在長鏈二元酸發酵過程中，必須經常性的對發酵液中長鏈二元酸含量進行分析，以合理的控制發酵進程。對發酵過程產酸量分析可以采用氣相色譜法、薄層色譜法、以及NaOH滴定法，其中氣相色譜法需使用價格昂貴的氣相色譜儀、還需對長鏈二元酸進行衍生處理，不但成本高、檢測時間長，而且對系統的各項要求也很高(中國科學院微生物研究所烴代謝組.微生物的正烷烴代謝Ⅰ假絲醉母的正烷經代謝產物的研究.微生物學報，1981，21(1)：88-95)；薄層色譜法同樣也存在檢測時間長、儀器設備要求高的問題(王麗華等.薄層色譜法分析十三碳二元酸及其單、雙甲酯.石油化工高等學校學報，2003，16(2)：29-32)。NaOH滴定法由于操作簡單，常用于發酵過程粗提產品中長鏈二元酸的快速分析，但滴定法存在較大誤差一直難以克服。李占朝等研究表明：為了獲得較準確的檢測結果，需要經過多次重復實驗，取其平均值(李占朝.十二碳二元酸的重結晶精制工藝研究.北京化工大學碩士學位論文，2009，17-26.)。此外，發酵生產長鏈二元酸粗提工藝大多采用酸沉淀法，直接利用NaOH滴定計算二元酸產量，提取物中無機酸殘留也會造成較大誤差。因此，研究建立一種簡便、準確、高效的長鏈二元酸檢測方法，可供實驗研究及實際生產的分析檢測所需。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用硫酸銅比色法快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸的方法。通過長鏈二元酸與硫酸銅-甲醇溶液的Cu²⁺反應形成沉淀，離心去除沉淀后，在600-850nm檢測上清液吸光值，根據標準曲線計算長鏈二元酸的含量。

本發明包括發酵長鏈二元酸樣品的制備，比色法快速分析長鏈二元酸含量兩部分。操作步驟如下：

(1)發酵長鏈二元酸樣品的制備

取體積為V₁的發酵液加1mol/l氫氧化鈉調節pH至9.5、60℃下振蕩30min使長鏈二元酸充分溶于水相中。離心使發酵液中固相、水相及發酵剩余烷烴分離，取出體積為V₂的水相部分，用6mol/L?HCl調pH值至2.0，加入2倍V₂體積的乙醚進行抽提，分相后乙醚萃取液倒入燒杯中，再以2倍V₂體積的乙醚重新萃取一次，合并萃取液，在通風櫥中吹去乙醚，得到白色固體即為長鏈二元酸粗提物。

(2)比色法快速分析長鏈二元酸含量

①配制硫酸銅-甲醇溶液：稱取1g硫酸銅加入干燥的錐形瓶中，量取20-200mL甲醇與硫酸銅混合，搖勻，至硫酸銅完全溶解。

②檢測波長的選擇：取硫酸銅-甲醇溶液進行光譜掃描，以最強吸收峰波長為檢測分析波長。對空白測定20次，方法的檢出限(3s/k)為0.011mg/mL。

③標準曲線的建立：精確稱量標準十二烷二酸25、50、75、100、125、150、175、200mg，加入5mL硫酸銅-甲醇反應溶液，使標準十二烷二酸濃度分別為5、10、15、20、25、30、35、40mg/mL(每個標準樣設3個平行)，常溫120rpm振蕩反應10-60min，5000rpm離心10min，取上清液于820nm波長處測定吸光值。以OD₈₂₀為橫坐標，標準十二烷二酸含量為縱坐標繪制工作曲線，線性回歸方程為C₁＝-91.185×OD₈₂₀+101.66，決定系數R²＝0.9920。

④樣品中長鏈二元酸含量分析：將一定量的待測物加入到5mL硫酸銅-甲醇反應監測溶液中，常溫120rpm振蕩反應10-60min，5000rpm離心10min，取上清液于820nm波長處測定吸光值。將吸光值代入標準曲線的線性回歸方程中，即可計算出檢測反應液中長鏈二元酸的含量。根據以下公式即可算出發酵液中長鏈二元酸含量(以十二烷二酸為標準)：