[發明專利]一種木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達載體及構建方法

無效

• 申請號: 201110009831.1
• 申請日: 2011-01-17
• 公開（公告）號: CN102154361A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 龔月生;楊明明;范鑫;宋秀平;張雯;張偉;曹鵬濤
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/66;C12N15/65;C12N1/21;C12N1/19;C12N9/42
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1.一種木聚糖酶表達載體，包括大腸桿菌復制子ColE1、枯草芽孢桿菌復制子B.sub.rep、篩選標記以及啟動子，在所述啟動子下游設有一信號肽序列和一木聚糖酶XynA基因序列。

2.權利要求1所述的木聚糖酶表達載體，其特征在于所述的信號肽序列為PhoB，具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列。

3.權利要求2所述的表達載體，其中表達所述信號肽PhoB的編碼基因為具有與SEQ?ID?NO：2所示核苷酸序列至少70％同一性的核苷酸序列。

4.權利要求1所述的木聚糖酶表達載體，其特征是所述的木聚糖酶XynA基因的堿基序列具有與SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列至少70％同一性的核苷酸序列。

5.權利要求1所述的木聚糖酶表達載體，其特征是所述的啟動子為麥芽糖啟動子Pglv。

6.權利要求1所述的木聚糖酶表達載體，其特征是所述的篩選標記為壯觀霉素抗性Spec。

7.含有權利要求1-6中任意一權利要求所述木聚糖酶表達載體的宿主細胞。

8.構建權利要求1-6中任意一權利要求所述木聚糖酶表達載體的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)構建載體pGJ148；

(2)以pGJ148為模板擴增獲得去氯霉素骨架載體并在兩端引入BglII酶切位點，再以shuttle為模板擴增壯觀霉素抗性基因(Sper+)在兩端引入BamH1酶切位點，然后分別用Bgl?II和BamH?I進行酶切，膠回收后連接這兩個片段獲得到中間載體pPS；

(3)以短小芽孢桿菌BYG5-20基因組為模板擴增木聚糖酶基因XynA去掉自身信號肽后的編碼區，用BamH?I和Sac?I消化后連接至pPS相應位點內，構建pPSX；

(4)在pPSX載體的EcoR?I至BamH?I之間插入了綠色熒光蛋白基因GFP，將篩選載體命名為pGPSX；

(5)將篩選出的能夠引導木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達的信號肽PhoB的編碼基因連接至信號肽篩選載體pGPSX上GFP所在位置，構建得到木聚糖酶表達載體PSX。

9.利用權利要求1至6中任一項權利要求所述的表達載體生產木聚糖酶的方法，是將所述表達載體導入宿主細胞，發酵表達得到外緣蛋白。

10.權利要求9所述的方法，其特征是所述的宿主細胞為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌。