[發(fā)明專利]IL-24-Tat PTD融合蛋白及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110009733.8
• 申請(qǐng)日: 2011-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN102153657A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏海濱;劉世海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/861;C12N15/66;A61K38/22;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201
• 代理人: 申忠才

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的融合蛋白及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

白細(xì)胞介素24(Interleukin?24，IL-24)又稱為黑色素瘤分化相關(guān)基因7(Melanomadifferentiation?associated?gene?7，MDA-7)，是Jiang等用消減雜交分析法，從重組的纖維母細(xì)胞干擾素和蛋白激酶C活化劑密執(zhí)毒素(mezerrein，MEZ)共同處理的黑色素瘤細(xì)胞株中篩選發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高表達(dá)基因。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，將該基因?qū)攵喾N腫瘤中后可引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯和凋亡，降低腫瘤細(xì)胞克隆的形成。由此證明它是一種新的抑癌基因。隨著對(duì)MDA-7研究的深入，根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)、染色體定位、氨基酸序列同源性以及具有細(xì)胞因子樣的特征，MDA-7被重新命名為IL-24，歸屬于IL-10家族。

IL-24表達(dá)于正常胸腺、脾和外周血液等免疫組織器官中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。在人的外周血單核細(xì)胞(Peripheral?blood?mononuclear?cells，PBMC)中，主要是活化的T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)IL-24；增殖活躍的正常黑色素細(xì)胞、早期黑色素瘤細(xì)胞和皮膚的平滑肌細(xì)胞也能檢測(cè)到IL-24表達(dá)，而在晚期黑色素瘤細(xì)胞中IL-24表達(dá)降低或缺失，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞IL-24表達(dá)缺失。

很多體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，IL-24可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)抑制黑素瘤、惡性膠質(zhì)瘤、骨肉瘤和乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)而不損害正常細(xì)胞，且其抑制腫瘤生長(zhǎng)作用不依賴于該類細(xì)胞中p53、pRB及p21等抑癌基因的活性狀態(tài)。除能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡外，IL-24還具有其他生物學(xué)功能如抗血管生成、免疫調(diào)節(jié)，增加放療和化療敏感性等。但是在慢性淋巴細(xì)胞白血病B細(xì)胞中，IL-24呈現(xiàn)高表達(dá)，其機(jī)理是促進(jìn)p38?MAPK的磷酸化，保護(hù)和促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。IL-24的生物學(xué)功能可以通過(guò)其受體來(lái)發(fā)揮作用。與IL-10家族的其他蛋白一樣，IL-24蛋白能夠與II型細(xì)胞因子受體IL-20RA/IL-20RB和IL-22R/IL-20RB受體結(jié)合，從而激活JAK/STAT(Janus?familykinase/signal?transducer?and?activator?of?transcription，JAK/STAT)通路。高表達(dá)IL-20R和IL-22R并不能明顯提高IL-24誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，而且利用酪氨酸激酶的特異性抑制劑Genistein和AG18，或者用JAK/STAT信號(hào)通路的特異性抑制劑AG490，并不影響IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。因此人們推測(cè)，IL-24引起的腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制與主要通過(guò)IL-20/IL-22受體來(lái)發(fā)揮作用的炎癥細(xì)胞因子的分子機(jī)制存在著差異。

IL-24目前已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，通過(guò)對(duì)IL-24所進(jìn)行的近十多年體內(nèi)和體外研究，以及隨之進(jìn)行的臨床I期實(shí)驗(yàn)，都證實(shí)了IL-24具有廣泛的抗腫瘤活性。由于IL-24能夠選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性，因此是一種理想的抗腫瘤藥物。目前作為IL-24的重組蛋白可以通過(guò)靶細(xì)胞表面的受體或其它途徑進(jìn)入靶細(xì)胞，以發(fā)揮抗腫瘤作用。但目前IL-24對(duì)腫瘤治療效果有待于進(jìn)一步提高。Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Tat?Protein?transduction?domain，Tat?PTD)是來(lái)源于人HIV?Tat蛋白。Tat?PTD目前已經(jīng)被廣泛用于與蛋白，siRNA或藥物交聯(lián)，以提高這些分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于對(duì)腫瘤治療效果好的IL-24-Tat?PTD融合蛋白。

本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于為IL-24-TatPTD融合蛋白提供一種構(gòu)建方法。

本發(fā)明所要解決的還有一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于為IL-24-Tat?PTD融合蛋白提供一種新用途。

解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：它是由IL-24與小肽兩部分所組成的融合蛋白，小肽位于IL-24的碳末端，其特征在于：所說(shuō)小肽是Tat?PTD，由11氨基酸(YGRKKRRQRRR)組成。

上述的IL-24-Tat?PTD融合蛋白的構(gòu)建方法由下述步驟組成：

1、攜帶IL-24融合蛋白基因的構(gòu)建