[發明專利]沙冬青抗寒基因AmGS

無效

• 申請號: 201110008899.8
• 申請日: 2011-01-06
• 公開（公告）號: CN102586269A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 馮殿齊;王斌;劉靜;宋鍵;曹鵬秀;翁曼麗;羅磊
• 申請（專利權）人: 泰安市泰山林業科學研究院;王斌
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N15/11;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發明從我國西北荒漠地區的源于遠古第三紀的國家二級瀕危保護植物，也是至今在亞洲中部荒漠地帶唯一保留下來的常綠闊葉木本植物沙冬青中克隆了其抗寒基因AmGS。AmGS含有完整的ORF區域，ORF全長987個核苷酸，編碼328個氨基酸和一個終止密碼子(TAA)。隨后構建了沙冬青抗寒基因AmGS的真核表達載體，用于轉化林木，獲得的轉基因林木植株抗寒性有所提高。AmGS來源于木本植物，因此轉化木本植物更容易表達，轉基因植株對環境沒有不良影響。它的克隆和對林木遺傳轉化的成功對木本植物抗寒研究和遺傳育種具有重要意義。

2.克隆的沙冬青抗寒基因AmGS的編碼序列全長987個核苷酸，它編碼328個氨基酸和一個終止密碼子(TAA)。用pCAMBIA2300為載體構建了AmGS的的表達載體pCAMBIA2300-AmGS，在建成的表達載體中CaMV35S啟動子、目的基因、終止子OCS和標記基因NPTII整合在一起構建成嵌合基因，有利于轉化和表達。

3.所用的標記基因是廣泛應用的來源于細菌的新霉素磷酸轉移酶基因(NPTII)，它編碼的產物對氨基葡糖苷類抗生素如卡那霉素等具有抗性，本表達載體不含報告基因GUS.

4.根據AmGS基因序列設計一對特異性引物。

正向引物：A12-v-1：??5′-TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT-3′

反向引物：A12-v-2：??5′-TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA-3′

擴增產物為1kp

正向引物設計在5′端載體序列上，反向引物設計在目的基因的3′端，用這對特異性引物擴增出的PCR產物為1Kb，包含是目的基因的全序列，這樣可以保證PCR擴增產物只能來自導入的AmGS基因序列，而不可能來自內源基因序列，提高了檢測的特異性和準確性。

1)反應液：

2)反應程序

預變性：94℃，5min

在以下條件下擴增35個循環：變性，94℃?60sec；復性，55℃?40sec；延伸，72℃，1min；最后延伸：72℃，5min?4℃，保存備用。?